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CGRP通过VEGF受体-2调节MG-63细胞增殖、迁移和collagen I表达

作　者: 周长臣
导　师: 张建设
学　校: 泸州医学院
专　业: 口腔医学
关键词: 人骨肉瘤细胞MG-63 CGRP VEGF受体-2 慢病毒
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是一种新型的内源性生物活性神经多肽，广泛分布于骨组织中。研究表明CGRP通过促进成骨细胞增殖、迁移和骨形成在骨折愈合中发挥关键作用，但其机制尚不明确。在内皮细胞中，CGRP可以通过提高VEGF、VEGF受体-2表达来增强内皮细胞的迁移，从而促进的血管形成。而据报道，在MG-63细胞中VEGF受体-2磷酸化升高可以明显提高MG-63细胞的存活率。VEGF-VEGFR系统在成骨细胞分化也发挥了重要作用。前期预实验显示，在MG-63细胞中，CGRP可以提高VEGF受体-2表达。因此，可以推测CGRP可能通过VEGFR调控骨折愈合。目的：构建VEGF受体-2干扰慢病毒载体，研究CGRP对VEGF受体-2干扰前后的MG-63增殖、迁移、VEGF受体-2表达及成骨标记collagenI表达，探讨VEGF受体-2在CGRP调控MG-63细胞增殖、迁移及骨形成相关蛋白表达变化中的作用。方法：1.将CGRP配成浓度分别为10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的培养液，MG-63细胞在上述CGRP培养液下作用5天后，采用Western bloting检测细胞中VEGF受体-2蛋白表达情况。初步探索CGRP对MG-63细胞VEGF受体-2表达的影响，并为后续实验选取合适的CGRP浓度提供基础。2.摘取文献报道的VEGF受体-2干扰siRNA序列，利用Western bloting验证干扰效果，将它构建到慢病毒载体中，通过PCR鉴定阳性克隆，并通过测序鉴定筛选出的阳性克隆。在293T细胞中进行病毒包装，纯化、滴度测定。3.将MG-63细胞接种到96孔板中，按MOI=30、60、100进行慢病毒感染预实验。4.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到6孔板，并在CGRP10-7mol/L下培养，利用Western bloting实验检测VEGFR-2蛋白表达。5.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到96孔板，并在CGRP10-7mol/L下培养，利用MTT实验检测1、2、3、4天OD值。6.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到24孔板，并在CGRP10-7mol/L下培养，进行Transwell实验，48h后进行穿膜细胞计数。7.将VEGFR-2干扰后的MG-63细胞接种到6孔板，并在CGRP10-7mol/L下培养，利用Western bloting检测collagenI的蛋白表达。结果：1.随着CGRP浓度的升高，MG-63细胞中VEGFR-2总蛋白的表达也提高。CGRP浓度在10-7mol/L时对VEGFR-2总蛋白的表达提高最明显。2.VEGFR-2干扰靶点的干扰效果有70%左右，说明干扰靶点有明显的干扰效果。3.通过PCR阳性克隆鉴定和测序证明构建的腺病毒表达质粒完全正确。通过试剂盒测定对照慢病毒滴度是6×108TU/mL，VEGFR-2干扰病毒的滴度是2×108TU/mL。4.荧光显微镜观察显示，VEGFR-2干扰慢病毒在MOI=100时感染MG-63细胞效果较好，感染效率可达90%，因此以MOI=100感染细胞进行后续试验。5. MG-63细胞、MG-63细胞+干扰对照病毒、MG-63细胞+VEGFR-2干扰病毒三组细胞经CGRP作用后VEGFR-2的相对表达量为1.30、1.23、0.53。MG-63+VEGFR-2干扰病毒组与MG-63细胞+干扰对照病毒组VEGFR-2的相对表达量相比明显降低，且差异明显（p<0.05)。6.随着培养时间的延长，MG-63+CGRP组与MG-63组细胞相比增殖速度加快，且有明显差异；MG-63+VEGFR-2干扰+CGRP组与MG-63+对照病毒+CGRP组细胞相比增殖速度降低，且有明显差异。7.MG-63+VEGFR-2干扰+CGRP组与MG-63+对照病毒+CGRP组相比侵袭能力明显降低，且差异非常显著（p<0.01），MG-63+CGRP组细胞与MG-63组细胞相比明显升高，且差异非常显著（p<0.01）。8.MG-63+VEGFR-2干扰+CGRP组与MG-63+对照病毒+CGRP组相比中collagenI蛋白的表达明显降低，且差异显著（p<0.05），MG-63+CGRP组细胞与MG-63组细胞中collagenI蛋白的表达相比明显升高，且差异非显著（p<0.05）。结论：CGRP能够提高MG-63细胞的增殖、迁移及软骨分化指标collagenI表达，VEGFR-2干扰后能够降低CGRP提高MG-63细胞的增殖、迁移及collagenI表达。因此，CGRP可能通过VEGFR-2调控MG-63细胞的增殖、迁移及collagenI表达。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-10
前言  10-11
材料和仪器  11-14
实验方法  14-23
结果  23-36
讨论  36-39
结论  39-40
参考文献  40-43
英文缩写一览表  43-44
综述  44-50
  参考文献  48-50

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 骨骼肿瘤
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