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白细胞介素12B基因多态性与早发冠心病相关性研究

作　者: 张再伟
导　师: 丁世芳
学　校: 南方医科大学
专　业: 心血管内科
关键词: 早发冠状动脉粥样硬化性心脏病基因多态性关联分析
分类号: R541.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景冠状动脉粥样硬化性心脏病,简称冠心病(Coronary atherosclerotic heart disease CAD),是一类严重影响人类身体健康的疾病。由动脉粥样硬化导致的心脑血管疾病包括冠心病、脑卒中已经成为现代社会中最主要致死和致残的原因,且发病趋势呈年轻化。早发冠心病是指发病年龄男性小于55岁,女性小于65岁的冠心病,是一种特殊类型的冠心病。近年来国内外研究表明早发冠心病有增多的趋势,其冠状动脉病变发生早或者病程发展迅速,是威胁中年人身体健康的重要原因。最新统计发现,在发达国家,CAD的死亡率有所下降,但在发展中国家,包括中国,CAD的死亡率仍呈惊人的上升趋势。据WHO估计,到2020年左右我国将会迎来CAD的流行高峰。CAD的防治仍是一项艰巨的任务。早发冠心病的相关致病基因较多,目前研究认为炎症是早发冠心病的一个独立危险因素,一些既与炎症又与早发冠心病密切相关的因子已成为近年来关注的焦点,深入研究这些因子,无疑会为早发冠心病的防治提供新的思路。冠心病的病理学说较多,包括脂质浸润学说、神经内分泌学说、同型半胱氨酸代谢障碍学说以及与炎症损伤有关的血管内膜损伤学说等。动脉粥样硬化疾病的发生由环境因素和遗传因素共同决定,且多呈复杂性遗传模式。通过家系定位克隆和候选基因关联分析,已经认识到一些基因在动脉粥样硬化的过程中发挥着作用。不同的病理学说涉及的环节中,炎症因子都是直接致病因子之一,因此研究炎症因子与冠心病的关联性逐渐成为热门研究对象。对冠心病这样的复杂疾病并不遵循孟德尔遗传模式,它们的遗传基础可能代表了多个DNA变异的累积。单核苷酸多态性是一种理解复杂疾病遗传方式的有前途的研究手段,该方法主要检测病例组与对照组广泛存在的不同基因位点,多位点单核苷酸多态性使基因功能的表达和翻译过程产生差异性,用病例组中累积的基因型频率和对照组中比较而不是单个的突变进行比较,尤其适用于候选基因的研究中。这种研究方法已经成功的应用于研究多种复杂疾病的研究。由于遗传因素和环境因素的相互作用是疾病发生发展的共同特点,国外对IL-12B遗传多态性在血管病变中致病作用进行了研究,由于人群的异质性、地域、饮食差异等原因,在不同种族中的研究结果不尽相同。相对于基因突变,单核苷酸多态性在生物学个体中较为常见,不同基因型可能对疾病的表型有更大的影响作用,这为我们研究早发冠心病的病因提供了思路。白细胞介素12B(IL-12B)属于炎症因子之一,其表达的强弱与机体免疫力相关,参与冠心病的发生发展过程。因此,明确白细胞介素12B基因与早发冠心病的关系对于早发冠心病的预防、治疗和预后有重要的临床意义和实际应用价值。IL-12B基因位于染色体5q31-33,调控活化的巨噬细胞和B细胞分泌IL-12B的一条重肽链p40的产生。IL-12B抗炎症作用机理主要包括：通过NKT细胞、CD4+T细胞和NK细胞等效应细胞起细胞毒作用；通过肿瘤坏死因子介导的间接清除结核杆菌作用：作用于NK细胞,产生内源性IFN-γ；通过直接调理先天免疫介导的吞噬细胞功能或活化补体系统起间接调理作用。目的本研究通过使用基于家系的遗传学研究的方法比较分析中国汉族早发冠状动脉粥样硬化性心脏病先证者与其生物学父母的白细胞介素12B(IL-12B)基因多态性分布的差异,揭示基因多态性与中国汉族早发冠状动脉粥样硬化性心脏病先证者的相关关系,探索该基因多态性在早发冠状动脉粥样硬化性心脏病发病的遗传机制中的意义,从而为早发冠状动脉粥样硬化性心脏病病因的研究和临床药物治疗提供一定的理论依据,并为该病的基因诊断和治疗提供初步的研究基础。方法在对早发冠状动脉粥样硬化性心脏病患者及其家属详细和完整地说明了本次研究的内容和意义后,获得了自愿参加研究的口头及书面同意。病例组为早发冠状动脉粥样硬化性心脏病患者。纳入标准：1)男性小于55岁及女性小于65岁；2)冠心病诊断标准为经皮冠脉造影证实至少一支冠脉血管狭窄大于50%；3)汉族；4)本人知情同意。排除标准：(符合以下任意一条即排除)：1)非汉族人群;2)有恶性肿瘤病史：3)严重肝肾功能不全;4)明确的血液系统疾病;5)明确的免疫性疾病等炎性疾病;6)明确的甲亢等甲状腺疾病;7)其他引起胸痛的原因如肺栓塞、心肌病、主动脉瘤、心脏瓣膜病及充血性心力衰竭;8)先证者的父或/和母死亡或相关资料难以获得者。对照组为患者生物学父母。纳入标准：1)年龄》50岁；2)汉族；3)无严重躯体疾病或脑器质性疾病；4)无自身免疫性疾病；5)无早发冠心病病史；6)本人知情同意。采取研究对象外周静脉血5ml,以0.5mol/l的EDTA (PH8.0)100μ1抗凝,室温放置15-30分钟后4000rpm离心15分钟,分离并弃血浆,沉淀全血细胞,-20℃冰箱冻存备用。在室温下使冻存的全血细胞标本解冻；在离心管中取100u1静脉血,采用Chelex100法提取DNA。琼脂糖凝胶电泳法鉴定提取的DNA。聚合酶链反应(PCR)：将溶于1m1TE(PH8.0)的基因组DNAO.5微升用TE(PH8.0)稀释10倍为5μl后作为模板。总反应体系25μ L。4个SNP位点,参考文献资料并采用Primer Premier5.0设计引物。rs15677380上游引物5’TTTGTCATCCCGTCTCCTTC3’,下游引物5’CAACAAAATATCCTGTGT TAGG T AGA3’; rs1203527793上游引物5’CAAAATGAAAGGT GGGAGGA3’,下游引物5’GGGGCTAAGTAGGCTGAAAAA3’; rs14050306上游引物5’CTGGCACTATCCCCCAAGTA3’,下游引物5’TTCAGTAGTGG CAGCAGTGG3’;rs13726393上游引物5’CATGACCTATGATTAATCTCTTCCA3’,下游引物5’CCTGTGAAGAAAAGGCCATA3’。扩增反应体系：采用25μ l的反应体系,该体系中含有：2×Tap PCR MasterMix12μL(产品组成：0.1U Tap Polymerase/μL,500μM dNTP each,20μM Tris-HCl (pH8.3),100μM KC1,3mM MgC12),上下游引物各2μL,DNA模板4μ L,双蒸水补充至总体积25μ L。PCR混合液先经95℃预处理5min,再经35个循环反应,然后延伸l0mim。对扩增产物酶切分型,酶切体系20μL,包括PCR扩增产物10μL,10×buffer2μ L,内切酶(rs15677380为DdeI,rs1203527793为SphI,rs14050306为Scr F I,rs13726393为Hpa I)0.2μL,双蒸水补充至总量20μ L。酶切产物在37℃孵箱中放置4h后用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离。其中rs1203527793采用聚丙稀酰胺凝胶电泳,并采用银染显色。根据酶切图谱判断基因型。使用全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。反应在Perkin-Elmer9600型扩增仪上进行。空腹胰岛素(FINS)、C-肽、尿微量白蛋白肌酐比测定用放射免疫分析法,HbAlC测定使用高压液相亲和层析法,空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)采用使用全自动生化分析仪。血常规血细胞分析五分类,尿常规分析采用尿液分析仪。操作严格按照说明书要求进行。胰岛素抵抗指数定义为空腹血浆胰岛素(mIU/L)×空腹血糖(mmol/L)／22.5。统计学方法：早发冠状动脉粥样硬化性心脏病病例组中,计量资料用均数±标准差表示,计量资料在病例组不同性别之间的比较采用两独立样本t检验,计量资料在病例组中同一位点基因型之间的差异比较采用方差分析方法,病例组不同性别之间基因型和等位基因频率的分布是否存在差异采用卡方检验,以上统计分析均使用SPSS17.0软件进行分析。早发冠状动脉粥样硬化性心脏病患者核心家系在rs15677380、rs1203527793、rs14050306、rs13726393位点上对病例组与对照组(病例的父母构成的组别)分别用R语言Genetics程序包做Hardy-Weinberg平衡定律检验；运用R语言Genetics程序包计算各位点的连锁不平衡关系,并对数据采用MCPDT程序包(http://www. stat. osu. edu/-statgen/SOFTWARE/MC-PDT/)做TDT检验,同时用FBAT1.7.3软件对数据进行疾病与基因之间的关联分析。各种检验均以P<0.05为差异有统计意义。结果(1)病例组：共入组348例,其中男性200例,女性148例；平均年龄(44.23±4.711)岁。(2)利用R语言Genetics程序包对父母组和病例组的基因型分别进行Hardy-We inberg平衡定律检验,病例组与父母组A/A,A/G,G/G基因型的观察值和期望值做Hardy-Weinberg平衡定律拟合优度检验：在rs13726393位点上,父母组X2=65.28,P<0.001,病例组X2=50.84,P<0.001；在rs15677380位点上,父母组X2=32.60,P<0.001,病例组X2=1.52,P=0.233;在rs14050306位点上,父母组X2=26.59,P<0.001,病例组X2=61.50,P<0.001；在rs1203527793位点上,父母组X2=1.16,P=0.2928,病例组X2=41.90,P<0.001。发现父母组中rs1203527793位点符合Hardy-Weinberg平衡定律,在病例组中rs15677380位点符合Hardy-Weinberg平衡定律。(3)所选rs13726393基因SNP位点存在能被Hpa I内切酶所识别的A和G二态性, rs15677380基因SNP位点存在能被Dde I内切酶所识别的A和G二态性,rs14050306基因SNP位点存在能被Scr F I内切酶所识别的A和G二态性,rs1203527793基因SNP位点存在能被SphI内切酶所识别的A和G二态性。(4)病例组不同性别之间在4个SNP位点上基因型和等位基因分布的差异比较进行卡方检验,只有rs13726393SNP位点上不同性别组之间基因型和等位基因频率分布无显著差异,rs15677380SNP位点上不同性别组之间等位基因频率分布无显著差异,其余SNP位点上不同性别组之间基因型和等位基因频率分布差异均有统计学意义。其中,在rs13726393位点上,男女基因型频率分布Z2=0.96,P=0.627,男女等位基因频率分布X2=0.29,P=0.591；在rs15677380位点上,男女基因型频率分布X2=43.60,P<0.001,男女等位基因频率分布X2=0.06,p=0.806;在rs14050306位点上,男女基因型频率分布X2=24.07,P<0.001),男女等位基因频率分布X2=26.44,P<0.001；在rs1203527793位点上,男女基因型频率分布X2=25.70,P<0.001,男女等位基因频率分布X2=11.45,P=0.001。(5)使用R语言Genetics程序包对四个位点分别进行两位点连锁不平衡分析。各位点在染色体上的位置如下：rs15677380为6065277,rs1203527793为61120383,rs14050306为64110562,rs13726393为6610754。rs15677380-rs1203527793的连锁不平衡分析结果为X2=47.57,P<0.001。rs15677380-rs14050306的连锁不平衡分析结果为X2=1.73,P=0.189。rs15677380-rs13726393的连锁不平衡分析结果为X2=3.49,P=0.060。rs1203527793-rs14050306的连锁不平衡分析结果为X2=6.13,P=0.013。rs1203527793-rs13726393的连锁不平衡分析结果为X2=1.30,P=0.254。rs14050306-rs13726393的连锁不平衡分析结果为X2=0.22,P=0.642。结果显示：rs15677380-：rs1203527793、rs1203527793-rs14050306位点间连锁不平衡,其余位点之间连锁平衡。(6)rs13726393等位基因与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病相关联(P=0.002),其中等位基因A为危险因素(Z=3.05),G是保护因素(Z=-3.05)；rs14050306与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P=0.002)；其中等位基因A为危险因素(Z=2.94),G是保护因素(Z=-2.94)；rs1203527793与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病无关联(P=0.171)；rs15677380与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P<0.001),其中等位基因A为保护因素(Z=-8.80),G为危险因素(Z=8.80)。IL-12B基因SNP2位点的单体型相对风险率分析,rsl5677380-rs1203527793的单体型中AG,GG,GA,从与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.001),rsl5677380-rs1405036的单体型中AG、AA、GG、GA与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.001),rs15677380-rs13726393的单体型中GG、GA、AA、GG与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.001)；rs1203527793-rs1405036的单体型中GA、AG与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P分别为0.002、0.025)；rs12035277933-rs13726393的单体型中GG、AA与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P分别为0.006、0.009)；rs1405036-rsl3726393的单体型中GA、GG与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.001)。其余各单体型与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病无关联(P>0.05)。IL-12B基因SNP3个SNP位点的单体型中rs15677380-rs1203527793-rs14050306的所有单体型都与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.05)；rs1203527793-rs14050306-rsl3726393的单倍体中GGT、GAG、AGA与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.001)；rs15677380-rs1203527793-rs13726393的单倍体中AGG、AAA、GAA、GGA、GGG与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.001)；rs15677380-rs1405036-rs13726393的单倍体中GAG、AGA、AGG、AAG、GAA与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联(P均小于0.001)。其余各单体型与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病无关联(P>0.05)。IL-12B基因SNP4个位点的SNP单体型分析时可见rs15677380-rs1203527793-rs1405036-rs13726393中的单倍体GAGG、GAAA、GGAA、GGGA、AAGA、AAAG、 AGGG与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病相关联(P均小于0.001)。其余各单体型与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病无关联(P>0.05)。(7)IL-12B四个SNP位点的基因型与冠状动脉狭窄评分、射血分数、C-反应蛋白、脂联素等各项临床检验指标进行比较,结果发现除脂联素在rs14050306位点上不同基因型之间差异有统计学意义(F=3.64,P=0.027)外,各位点上不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论(1)在中国汉族人群中IL-12B基因4个SNP位点酶切分型与国外报道一致,但各位点多态性的变异度均高于国外人群。(2)IL-12B基因SNP位点的等位基因关联性分析rs13726393、rsl4050306、rs15677380等位基因与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病相关联。(3)IL-12B基因SNP位点的单体型与早发冠状动脉粥样硬化性心脏病有关联。

全文目录

摘要  3-11
ABSTRACT  11-20
第一章前言  20-32
  1 早发冠心病流行病学研究进展  20-21
  2 早发冠心病发病机制  21-23
  3 早发冠心病分子生物学研究进展  23-27
  4 早发冠心病基因学研究尚需解决的问题  27-28
  5 本研究思路及拟解决的问题  28-32
第二章对象与方法  32-44
  1 研究对象  32
  2 研究步骤  32-34
  3 主要试剂和设备  34-36
  4 分子生物学实验  36-41
  5 临床检验方法  41-43
  6 统计学方法  43-44
第三章结果  44-62
  1 一般资料  44-45
  2 Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验  45-49
  3 IL-12B等位基因酶切结果  49-51
  4 早发冠心病核心家系IL-12B基因型和等位基因频率分布的比较  51-53
  5 IL-12B基因SNP位点的连锁分析  53-54
  6 IL-12B基因SNP位点的等位基因关联性分析和单体型相对风险率分析  54-59
  7 IL-12B基因型与早发冠心病临床检验的关系  59-62
第四章讨论  62-81
  1 本研究使用的遗传学统计方法的优缺点  62-68
  2 本研究所选择的基因研究方法  68-70
  3 本研究所选择的基因位点情况  70
  4 本研究结果的意义分析  70-78
  5 本研究的特点、局限性以及未来研究趋势  78-81
第五章结论与展望  81-82
  1 结论  81
  2 展望  81
  3 存在的问题和进一步的研究思路  81-82
参考文献  82-93
综述  93-104
  参考文献  100-104
致谢  104-105
在读期间发表的论文  105-106
缩略词表  106-107

白细胞介素12B基因多态性与早发冠心病相关性研究

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