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Tetl基因在猪诱导多潜能干细胞特性维持中的作用研究

作　者: 范安然
导　师: 李子义
学　校: 吉林大学
专　业: 动物学
关键词: 诱导多潜能干细胞（iPS） Tet1 基因表达甲基化羟甲基化猪
分类号: R457.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

过表达胚胎特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc，能将已分化的小鼠成纤维细胞重编程为多潜能状态，即诱导多潜能干细胞（iPS）。随后不同物种、不同组织来源的靶细胞iPS建系的研究相继开展，包括猪的iPS。最近发现TET家族蛋白（包括Tet1、Tet2、Tet3三个家族成员）能氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），从而促进DNA的主动去甲基化。Tet1在小鼠的胚胎干细胞(mES)中表达量很高，并已经被证明参与小鼠mES的维持。本实验通过诱导多潜能干细胞技术以及RNA干扰技术研究了Tet1基因在猪iPS（piPS）中的作用。结果显示：（1）鼠源的逆转录病毒递送系统Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc，在猪胚胎成纤维细胞中仍然适用，可以将猪胚胎成纤维细胞（PEF）重编程为iPS，所得iPS克隆形态与人的ES相似，呈扁平状。piPS表达干细胞标记OCT4、SOX2、NANOG、REX1和SSEA4。piPS在体外能形成拟胚体，拟胚体中表达三胚层标记基因Afp、Bmp4、Gfap。将piPS注射到裸鼠皮下，能形成三个胚层起源的组织，包括外胚层起源的神经上皮，中胚层起源的血管、横纹肌，内胚层起源的滤泡样结构；（2）化学合成了Tet1的4种siRNA，其中2种siRNA能有效干扰Tet1表达。siRNA干扰Tet1表达后，piPS失去自我更新状态，开始分化并影响基因表达。Tet1表达下调后，谱系分化相关基因Pitx2、Hand1、Gata6和Lef1表达上升，多能性相关基因Lefty2、Klf2、Sox2表达下降，而Oct4、c-Myc、Klf4和Nanog的表达没有明显变化；（3）siRNA干扰Tet1表达后，Oct4、c-Myc启动子区域5mC含量明显上升，Sox2、Nanog启动子区域5mC含量没有变化，Klf4启动子区域5mC含量轻度上升；Tet1下调后，全基因组水平的5mC含量上升，而5hmC含量下降。

全文目录

内容提要  5-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-12
目录  12-15
英文缩写词表  15-16
前言  16-18
第一篇文献综述  18-52
  第1章表观遗传修饰  18-28
    1.1 发育中的表观遗传修饰  18-20
      1.1.1 DNA 甲基化  18-19
      1.1.2 组蛋白修饰  19-20
    1.2 胚胎干细胞中的表观遗传修饰  20-22
    1.3 ES 细胞中表观遗传景观  22-25
    1.4 分化过程中表观遗传的动态变化  25-28
  第2章细胞重编程与 iPS  28-42
    2.1 细胞重编程历史  28-31
      2.1.1 核移植与动物克隆  28
      2.1.2 多能干细胞系与融合杂交  28-29
      2.1.3 转录因子与谱系转换  29-30
      2.1.4 iPS 细胞  30-31
    2.2 产生 iPS 细胞的技术  31-32
    2.3 iPS 形成的可能机制  32-39
      2.3.1 精英模型与随机模型  32-33
      2.3.2 重编程的屏障  33-35
      2.3.3 重编程因子在表观遗传重塑中的作用  35-37
      2.3.4 拮抗与协同因子  37-39
    2.4 iPS 细胞应用  39-42
      2.4.1 iPS 细胞与细胞疗法  39-40
      2.4.2 使用 iPS 细胞的药物开发  40-42
  第3章 5-羟甲基胞嘧啶与 TET 家族  42-52
    3.1 5-羟甲基化的发现和历史  42-43
    3.2 TET 家族蛋白的发现及其结构  43-44
    3.3 5hmC 检测技术和发展  44-46
    3.4 TET 蛋白作用机制  46-48
    3.5 TET 蛋白和 5hmC 在小鼠发育中的作用  48-52
      3.5.1 TET 蛋白在原始生殖细胞和配子中的作用  48-49
      3.5.2 TET 蛋白在合子中的作用  49
      3.5.3 TET 蛋白在植入前、植入后胚胎和 ES 中的作用  49-50
      3.5.4 TET 蛋白在出生后发育中的作用  50-51
      3.5.5 TET 家族蛋白和 5hmC 在人类癌症中的作用  51-52
第二篇实验研究  52-100
  第1章猪 iPS 诱导与鉴定  52-70
    1.1 材料试剂  53-55
      1.1.1 实验动物  53
      1.1.2 主要仪器  53
      1.1.3 主要耗材  53-54
      1.1.4 主要试剂及配制方法  54-55
    1.2 实验方法  55-60
      1.2.1 小鼠原代胎儿成纤维细胞（MEF）分离培养  55-56
      1.2.2 小鼠饲养层细胞（Feeder）制备  56
      1.2.3 约克夏猪原代胎儿成纤维细胞（PEF）分离培养  56-57
      1.2.4 逆转录病毒包装  57
      1.2.5 诱导 PEF 重编程为 iPS  57-58
      1.2.6 免疫荧光染色  58
      1.2.7 拟胚体形成实验  58
      1.2.8 畸胎瘤形成实验  58-59
      1.2.9 HE 染色  59-60
      1.2.10 嵌合体制备  60
    1.3 结果  60-68
      1.3.1 PEF 重编程为 iPS  60-61
      1.3.2 猪 iPS 多能性标记表达及体外分化能力鉴定  61-63
      1.3.3 畸胎瘤形成实验  63-65
      1.3.4 嵌合体猪制备  65-68
    1.4 讨论  68-69
    1.5 小结  69-70
  第2章 Tet1 下调对猪 iPS 基因表达的影响  70-86
    2.1 材料试剂  70-72
      2.1.1 实验动物  70
      2.1.2 主要仪器  70-71
      2.1.3 主要耗材  71
      2.1.4 主要试剂及配制方法  71-72
    2.2 实验方法  72-76
      2.2.1 siRNA 转染猪 iPS 细胞系  72-73
      2.2.2 流式细胞仪筛选阳性细胞  73
      2.2.3 RNA 提取与 cDNA 合成  73-74
      2.2.4 常规 PCR 与荧光定量 PCR  74
      2.2.5 Western Blot  74-76
    2.3 结果  76-82
      2.3.1 Tet1 在猪 iPS 中的表达  76-78
      2.3.2 siRNA 转染 iPS  78-79
      2.3.3 siRNA 转染猪 iPS 后发生的形态学变化  79-80
      2.3.4 siRNA 转染 iPS 后对谱系分化相关基因表达的影响  80-81
      2.3.5 siRNA 转染 iPS 后对多能性相关基因表达的影响  81-82
    2.4 讨论  82-84
    2.5 小结  84-86
  第3章 Tet1 下调对 iPS 的 DNA 甲基化状态的影响  86-100
    3.1 材料试剂  86-87
      3.1.1 实验动物  86
      3.1.2 主要仪器  86-87
      3.1.3 主要耗材  87
      3.1.4 主要试剂及配制方法  87
    3.2 实验方法  87-90
      3.2.1 基因启动子区域 CpG 岛分析以及亚硫酸氢盐测序引物设计  87-88
      3.2.2 甲基化分析：亚硫酸氢盐转化后 DNA 测序（BSP）  88
      3.2.3 羟甲基化分析：糖基化酶切 PCR  88-89
      3.2.4 Dot Blot  89-90
    3.3 结果  90-96
      3.3.1 多能性相关基因启动子区域 5hmC 检测  90-91
      3.3.2 Tet1 下调后，多能性相关基因启动子区域甲基化状态  91-95
      3.3.3 Tet1 敲低后，基因组水平上的 5mC 与 5hmC 状态  95-96
    3.4 讨论  96-98
    3.5 小结  98-100
结论  100-102
参考文献  102-130
导师简介  130-132
攻读博士期间发表论文情况  132-134
附录  134-136
致谢  136

Tetl基因在猪诱导多潜能干细胞特性维持中的作用研究

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