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猪胎儿成纤维细胞和卵巢表皮上皮细胞重编程能力的比较研究

作　者: 刘莹
导　师: 李亚辉; 郑萍
学　校: 云南农业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 诱导多潜能干细胞（iPS细胞）重编程效率卵巢表皮上皮细胞胎儿成纤维细胞
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

iPS细胞（inducedpluripotentstemcells），被称为诱导多潜能干细胞，是通过往体细胞中转入若干基因(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog,Lin28)，使其逆向回到胚胎干细胞样状态。iPS细胞除了来源外，其他特征和胚胎干细胞完全一致，具有多向分化潜能，理论上可以分化成所有类型的细胞。本研究以二种不同类型的猪细胞作为诱导多潜能干细胞的实验材料。首先，通过分离、纯化、鉴定，建立了猪卵巢表皮上皮细胞系。其次，利用Lipofectamine2000对pMXs-mOct4、pMXs-mSox2、pMXs-mc-Myc、pMXs-mKlf4进行病毒包装。最后，利用包装好的逆转录病毒将4种特定的转录因子导入猪胎儿成纤维细胞及猪卵巢表皮上皮细胞，对其进行重编程诱导产生干细胞，并比较其重编程效率。研究发现猪胎儿成纤维细胞的代数越早其重编程能力越强，而猪卵巢表皮上皮细胞在发生完全成纤维转变后其重编程能力较好。本研究为供体细胞的选择提供了一定的依据。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
1 前言  8-20
  1.1 动物细胞培养概述  8-11
    1.1.1 动物细胞培养的发展历史  8-9
    1.1.2 动物细胞体外培养技术的应用  9-10
      1.1.2.1 在生物学基础研究中的应用  9-10
      1.1.2.2 在动物细胞产品开发中的应用  10
      1.1.2.3 在医药医学中的应用  10
      1.1.2.4 在动物遗传育种中的应用  10
    1.1.3 动物细胞培养的发展方向  10-11
      1.1.3.1 临床生物治疗  10-11
      1.1.3.2 疫苗研制  11
      1.1.3.3 药理检测模型  11
  1.2 卵巢表皮上皮的生物学特性及研究进展  11-14
    1.2.1 成年动物体内的卵巢表皮上皮  11-13
      1.2.1.1 卵巢表皮上皮的结构  11-12
      1.2.1.2 卵巢表皮上皮的功能  12
      1.2.1.3 卵巢表皮上皮的特性  12-13
    1.2.2 卵巢表皮上皮细胞的体外培养  13-14
      1.2.2.1 体外常规培养方法及鉴定手段  13
      1.2.2.2 三维体外培养体系  13-14
      1.2.2.3 物种间卵巢表皮上皮细胞性质的变化  14
  1.3 胎儿成纤维细胞的生物学特性及其应用  14-15
  1.4 细胞转染技术简介  15
  1.5 诱导多潜能干细胞的研究进展及其应用  15-18
    1.5.1 国内外研究进展  16-17
    1.5.2 诱导多潜能干细胞的应用  17-18
  1.6 研究目的及实验技术路线  18-20
2 实验材料与方法  20-30
  2.1 实验设备  20
  2.2 实验材料  20
  2.3 实验试剂  20-23
  2.4 实验方法  23-30
    2.4.1 猪卵巢表皮上皮细胞系的建立  23-25
      2.4.1.1 猪卵巢表皮上皮细胞的分离  23
      2.4.1.2 猪卵巢表皮上皮细胞的纯化  23-24
      2.4.1.3 猪卵巢表皮上皮细胞的传代  24
      2.4.1.4 猪卵巢表皮上皮细胞的冻存  24
      2.4.1.5 猪卵巢表皮上皮细胞的生物学检测  24-25
      2.4.1.6 猪卵巢表皮上皮细胞特异性蛋白的检测  25
    2.4.2 病毒包装  25-27
      2.4.2.1 质粒转化及摇菌  25-26
      2.4.2.2 质粒的提取  26-27
      2.4.2.3 利用Lipofectamine2000进行病毒包装  27
    2.4.3 两种细胞重编程能力的比较  27-30
      2.4.3.1 猪胎儿成纤维细胞及猪卵巢表皮上皮细胞的准备  27-28
      2.4.3.2 细胞转染  28
      2.4.3.3 小鼠胚胎成纤维细胞的分离  28-29
      2.4.3.4 饲养层的制作  29
      2.4.3.5 重编程过程的观察  29
      2.4.3.6 碱性磷酸酶染色  29-30
3 实验结果  30-41
  3.1 猪卵巢表皮上皮细胞系的建立  30-35
    3.1.1 猪卵巢表皮上皮的分离  30
    3.1.2 猪卵巢表皮上皮细胞的纯化  30-31
    3.1.3 猪卵巢表皮上皮细胞的生物学检测  31-33
      3.1.3.1 细胞接种成活率  31-32
      3.1.3.2 细胞群体倍增时间  32
      3.1.3.3 细胞生长曲线  32-33
      3.1.3.4 细胞直径的统计  33
    3.1.4 猪卵巢表皮上皮细胞特异性蛋白的检测  33-35
      3.1.4.1 角蛋白免疫荧光染色结果  33-34
      3.1.4.2 CD31免疫荧光染色结果  34-35
      3.1.4.3 factorⅧ免疫荧光染色结果  35
  3.2 病毒包装  35-38
    3.2.1 质粒的转化及摇菌  35
    3.2.2 质粒的提取  35-37
    3.2.3 利用Lipofectamine2000进行病毒包装  37-38
  3.3 两种细胞重编程能力的比较  38-41
    3.3.1 利用逆转录病毒转染细胞  38-39
    3.3.2 重编程过程的观察  39
    3.3.3 碱性磷酸酶染色  39-41
4 讨论  41-47
  4.1 猪卵巢表皮上皮细胞系的建立  41-42
  4.2 病毒包装  42-44
  4.3 两种细胞重编程能力的比较  44-47
5 结论  47-48
  5.1 猪卵巢表皮上皮细胞系的建立  47
  5.2 病毒包装  47
  5.3 两种细胞重编程能力的比较  47-48
6 创新点  48-49
参考文献  49-55
致谢  55-56
附录  56

猪胎儿成纤维细胞和卵巢表皮上皮细胞重编程能力的比较研究

内容摘要

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