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TNFR1的内化与脂筏关系的探讨

作　者: 韩璐
导　师: 王晶
学　校: 华中科技大学
专　业: 分子免疫学
关键词: TNFR1 sTNF-α 内化脂筏凋亡
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
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内容摘要

脂筏和小窝是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，在启动许多信号通路中起到很重要的作用。小窝在质膜上形如瓶颈形凹陷，是脂筏的一个子集。内化作用可在细胞内体表面募集信号分子并激活相应的信号级联反应来启动信号通路[1-3]。受体和配体可以通过多种途径从细胞表面发生内化。其中最主要的是网格蛋白介导的内化作用，除此之外，脂筏也能介导内化作用[4,5]。大量研究证实sTNF-α通过TNFR1既可以活化NF-κB，促进细胞生存，又可以诱导细胞凋亡。而后者依赖于受体内化,在胞浆形成DISC信号复合物。本室前期工作发现，用MCD破坏Hela细胞的脂筏，可以显著增强sTNF-α的细胞毒效应（p<0.01）。我们推测破坏脂筏可能通过促进TNFR1内化，抑制了生存信号NF-κB的活化，促进DISC的形成，从而增强sTNF-α介导的杀伤效应。本研究主要探讨脂筏与TNFR1内化的关系，其主要结果如下：一、确定MCD作用的最佳浓度1.结合前期试验和相关文献，测定不同时间点及不同浓度的MCD对细胞的胞毒效应，确定在45min时，7.5mM及以下浓度的MCD对细胞毒性小。2.前期试验证明，破坏脂筏可降低细胞的粘附能力。同质粘附实验证实，5mM及以上浓度的MCD能显著降低细胞的粘附现象。故以下实验采用MCD浓度为5mM，作用时间为45min。二、破坏脂筏可增强sTNF-α介导的细胞杀伤和凋亡1.将野生型TNFR1和内化缺陷的突变体TNFR1-Y236A转染293T细胞，结果证实用MCD破坏脂筏，sTNF-α对转染野生型TNFR1靶细胞的胞毒效应升高了18.7%（p<0.05），而对转染TNFR1-Y236A细胞的胞毒效应则无明显影响。提示MCD有可能通过影响TNFR1内化来影响靶细胞对sTNF-α的应答。2.用MCD破坏高表达TNFR1的Hela细胞的脂筏，不但可促进sTNF-α介导的胞毒效应，且可提高sTNF-α诱导的caspase-8和caspase-3的活化，提示破坏脂筏可明显促进sTNF-α介导的凋亡。三、破坏脂筏减少表达在细胞表面的TNFR1用MCD破坏Hela细胞的脂筏，用流式细胞术检测sTNF-α刺激后，靶细胞表面TNFR1的表达率。结果显示，脂筏的破坏使膜表面TNFR1的表达率下降了13.17%（p<0.05）,而Western blot显示MCD并不影响细胞内TNFR1的总表达量。提示脂筏破坏可能促进sTNF-α介导的TNFR1内化。四、构建定位于脂筏内的TNFR1突变体正常情况下，TNFR1部分在脂筏内，部分在脂筏外。为使所有TNFR1定位在脂筏内，我们通过重迭PCR将驻留于脂筏内的caveolin1脂筏定位结构域(301-378)连接到TNFR1胞内内化结构域(1-729)。突变体命名为TNFR1-CAV，将其连接到N1-EGFP质粒上，并瞬转293T细胞，其表达效率达到62.4%时，提取脂筏，通过抗TNFR1抗体和GFP抗体，均证实TNFR1-CAV－GFP融合蛋白全部定位在脂筏层中。五、激光共聚焦扫描显微镜观察TNFR1及其几种突变体的内化分别对293T细胞转染标记了GFP的TNFR1，TNFR1-Y236A，TNFR1-ΔDD，TNFR1-CAV，在激光共聚焦扫描显微镜下观察，发现破坏脂筏可明显促进sTNF-α诱导的野生型和缺失DD的TNFR1的内化，但缺失内化结构域的TNFR1则在任何刺激下不发生内化。有意思的是sTNF-α不能诱导所有定位于脂筏内的TNFR1-CAV发生内化，但用MCD破坏脂筏后，这种配体诱导的受体内化则重新出现，提示脂筏能够保护TNFR1不内化。综上所述，本研究证实脂筏可通过干扰受体内化而参与决定靶细胞对sTNF-α的应答，凋亡还是存活？故以脂筏为靶点，可能改变靶细胞例如肿瘤细胞对某些因子的信号转导，为临床治疗相关疾病提供新的思路。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-15
材料和方法  15-31
实验结果  31-44
讨论  44-47
小结  47-48
参考文献  48-53
综述  53-69
  参考文献  62-69
致谢  69

TNFR1的内化与脂筏关系的探讨

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