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重症病毒性肝炎凋亡相关分子Fas，TNFR1miRNA腺病毒载体的构建及其体外干预研究

作　者: 叶华丽
导　师: 杨道锋；宁琴
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: 重症病毒性肝炎基因治疗 miRNA Fas TNFR1 腺病毒载体
分类号: R512.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:构建小鼠pcDNA3.1-mFas表达质粒和pcDNA6.2-mFas-miRNA、pcDNA6.2-mTNFR1-miRNA的联合表达质粒pcDNA6.2-mFas-mTNFR1-miRNA,将miRNA表达质粒连到腺病毒载体上得到腺病毒颗粒Ad-mFas-miRNA、Ad-mTNFR1-miRNA及Ad-mFas-mTNFR1-miRNA。并初步评价pcDNA6.2- mFas-miRNA,pcDNA6.2-mTNFR1-miRNA表达质粒和Ad-mFas-mTNFR1- miRNA腺病毒颗粒对mFas和mTNFR1基因表达的干预效果。方法:在构建pcDNA6.2-mFas-miRNA和pcDNA6.2-mTNFR1-miRNA质粒的基础上,构建了联合表达质粒pcDNA6.2-mFas-mTNFR1-miRNA。利用Gateway技术,分别将mFas、mTNFR1、mFas-mTNFR1及非相关的miRNA的pcDNA表达质粒重组成腺病毒表达载体。腺病毒的不完整颗粒通过感染293A细胞,使腺病毒得到完整的复制系统,成为腺病毒表达载体,扩增腺病毒得到高滴度的腺病毒颗粒。在体内外验证pcDNA6.2-mFas-miRNA,pcDNA6.2-mTNFR1-miRNA表达质粒的干预效果。体外实验检测腺病毒颗粒Ad-mFas-mTNFR1-miRNA对mFas和mTNFR1的体外干预效果,Realtime -PCR检测细胞中mRNA水平的表达水平,Western Blot检测细胞中蛋白质的表达水平。结果:成功构建了pcDNA3.1-mFas、pcDNA6.2-mFas-mTNFR1-miRNA、Ad-mFas-miRNA、Ad-mTNFR1-miRNA、Ad-mFas-mTNFR1-miRNA腺病毒表达载体。体外实验显示,与对照组相比,pcDNA6.2-mFas-miRNA、pcDNA6.2- mTNFR1-miRNA能够在mRNA水平和蛋白水平特异性地抑制目标基因mFas和mTNFR1的表达。体内实验显示, pcDNA6.2-mFas-miRNA、pcDNA6.2- mTNFR1- miRNA对暴肝小鼠的生存率分别提高分别提高了11.1%和20%。在体外,腺病毒颗粒Ad-mFas-m TNFR1-miRNA能够在mRNA水平和蛋白质水平显著地抑制mFas和mTNFR1的表达。结论:成功构建了pcDNA3.1-mFas表达质粒,构建了pcDNA6.2-mFas-miRNA,pcDNA6.2-mTNFR1-miRNA的联合表达质粒pcDNA6.2-mFas-mTNFR1-miRNA,构建了Ad-mFas-miRNA、Ad-mTNFR1-miRNA、Ad-mFas-mTNFR1-miRNA腺病毒颗粒;初步证实pcDNA6.2-mFas-miRNA,pcDNA6.2-mTNFR1-miRNA表达质粒和Ad-mFas-mTNFR1-miRNA腺病毒颗粒能够特异性地抑制目标基因mFas和mTNFR1的表达,pcDNA6.2-mFas-miRNA,pcDNA6.2-mTNFR1-miRNA表达质粒对小鼠生存率有较明显的提高,为进一步的实验奠定了基础。研究意义:重症病毒性肝炎是严重危害人民生命健康的疾病,在缺乏肝移植的情况下,其死亡率高达80%～90%。本研究通过构建重症病毒性肝炎相关基因Fas、TNFR1的miRNA表达质粒及其腺病毒表达载体,并在体内外实验检测其对mFas、mTNFR1的干预效果,从而为重症病毒性肝炎的基因治疗提供新的思路。

重症病毒性肝炎凋亡相关分子Fas，TNFR1miRNA腺病毒载体的构建及其体外干预研究

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