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罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究

作　者: 李庆勇
导　师: 卢迈新
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 罗非鱼无乳链球菌 C5a肽酶原核表达免疫原性疫苗
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，可导致水生动物、哺乳动物及人类等患败血症、肺炎及脑膜炎等疾病。无乳链球菌已经成为多种鱼类的主要致病菌，尤其是暖水性鱼类，给水产养殖业，特别是集约化鱼类养殖造成巨大的经济损失，也是危害我国养殖罗非鱼的主要病害，已经严重阻碍了我国罗非鱼产业链的健康发展。本研究以罗非鱼无乳链球菌为对象，通过生物信息学、分子生物学等技术，克隆了无乳链球菌ZP-N菌株C5a肽酶scpB基因，分析了ScpB蛋白抗原表位的分布，并利用原核表达获得了有活性的重组蛋白，同时对该蛋白的免疫原性进行了研究。主要研究内容及结果如下：1无乳链球菌scpB基因的克隆及原核表达质粒的构建为了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息，本文通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA，利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明，该基因包括3405bp的ORF，可编码1134个氨基酸，与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X2.0和MEGA5.05及在线分析工具ExPASyProtParam、NCBI Proten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析，结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列含有3个催化三联体(Catalytic triad)位点，7个假定活性位点(Putative active site)，2个特异位点(Specifichits)，以及4个超家族结构（2个肽酶超家族结构Peptidases-S8-S53superfamily，1个类纤连蛋白超家族结构DUF1034superfamily和1个鞭毛钩蛋白超家族结构FlgD-lg superfamily）。ScpB氨基酸序列有多个抗原表位，推测ScpB蛋白应具有较强的免疫原性，可作为候选的蛋白疫苗成分。将该基因片段插入原核表达载体pET32a(+)，转入大肠杆菌BL21(DE3)。挑取阳性克隆，经PCR、酶切及测序鉴定表明成功构建原核表达载体pET32a+/scpB，为获得大量ScpB蛋白开展其免疫防治提供了条件。2无乳链球菌C5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究本研究从本实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌基因组DNA中扩增出scpB基因高保守片段，构建原核表达质粒pET32a(+)-scpB，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导重组蛋白表达，表达的重组蛋白用镍离子金属螯合柱纯化及超滤管浓缩除盐，采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。纯化的融合蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合制成疫苗后免疫罗非鱼以分析其免疫原性。免疫罗非鱼后，每周采血测各组血清中溶菌酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力及抗体水平变化情况，直至实验结束。免疫罗非鱼4周后对其进行人工攻毒试验，结果显示：免疫组的相对免疫保护率达69.66%-89.0%，其中5μg/g剂量组的保护率最高；免疫后血清中溶菌酶活性、SOD活力和抗体水平得到极显著的提高(P<0.01)。本研究表明重组蛋白ScpB具有较强的免疫原性和保护作用，为无乳链球菌多肽疫苗的研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础。3PLGA为佐剂的C5a肽酶纳米疫苗对罗非鱼无乳链球菌病的免疫效果研究利用超声乳化法技术，采用生物可降解材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹无乳链球菌表面蛋白ScpB制成缓释微球疫苗，不同浓度注射免疫罗非鱼。监测受免鱼体血清中溶菌酶活性、SOD活力及抗体(IgM)水平变化情况，并计算其人工攻毒后相对免疫保护率。结果表明，制备的微球疫苗中蛋白的载药率达2.55%，包封率为48.76%。免疫组血清中溶菌酶活性、SOD活力和抗体水平极显著提高(P<0.01)；免疫组的相对免疫保护率达66.80%-87.66%，其中1μg/g剂量组(P1)的保护率最高。该结果表明采用PLGA作为无乳链球菌ScpB蛋白疫苗的载体和佐剂具有较好的免疫效果和较持久的免疫保护作用。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
引言  11-19
  1 无乳链球菌特征  12
    1.1 无乳链球菌分类地位、形态及特点  12
    1.2 无乳链球菌分子型别  12
  2 无乳链球菌对罗非鱼养殖业的危害  12-13
    2.1 致病性及危害  12-13
    2.2 症状及流行病学  13
  3 罗非鱼链球菌病的防治现状  13-16
    3.1 药物防治  13-14
    3.2 生态防治  14
    3.3 疫苗防治  14-16
  4 无乳链球菌表面蛋白研究进展  16-18
    4.1 LrrG 蛋白  17
    4.2 Sip 蛋白  17-18
    4.3 C5a 肽酶  18
  5 本研究的目的和意义  18-19
第一章罗非鱼无乳链球菌 scpB 基因的克隆及原核表达质粒的构建  19-38
  1 材料与方法  19-25
    1.1 菌株  19
    1.2 试剂  19-20
    1.3 培养基及缓冲液的配制  20
    1.4 引物设计与合成  20-21
    1.5 无乳链球菌 scpB 基因的 PCR 扩增  21-23
    1.6 scpB 基因克隆质粒的构建  23
    1.7 scpB 基因核酸序列特征分析  23
    1.8 ScpB 氨基酸序列特征分析  23
    1.9 ScpB 氨基酸序列的同源性分析  23
    1.10 scpB 基因重组表达质粒的构建  23-25
  2 结果  25-35
    2.1 无乳链球菌 scpB 基因的 PCR 扩增及 T 克隆鉴定  25-26
    2.2 scpB 基因核酸序列分析  26-27
    2.3 ScpB 氨基酸序列特征分析  27-32
    2.4 ScpB 氨基酸序列抗原性分析  32-35
    2.5 ScpB 蛋白氨基酸序列的同源性分析  35
    2.6 重组表达质粒的构建与鉴定  35
  3 讨论  35-38
第二章罗非鱼无乳链球菌 C5a 肽酶的原核表达及其免疫原性研究  38-56
  1 材料和方法  38-48
    1.1 菌株和实验动物  38
    1.2 酶和试剂  38-39
    1.3 溶液和缓冲液  39-41
    1.4 无乳链球菌 scpB 基因扩增及克隆  41
    1.5 scpB 基因表达载体的构建  41-42
    1.6 ScpB 蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 分析  42-43
    1.7 重组蛋白包涵体复性  43-44
    1.8 重组蛋白纯化  44-45
    1.9 重组蛋白的 Western blot 分析及其免疫与攻毒试验  45-46
    1.10 免疫罗非鱼血清采集及免疫指标分析  46-47
    1.11 血清抗体水平的测定  47-48
    1.12 数据处理  48
  2 结果  48-53
    2.1 scpB 基因克隆和重组表达质粒的构建与鉴定  48-50
    2.2 ScpB 蛋白的诱导表达、纯化及 Western blot 分析  50
    2.3 ScpB 蛋白的免疫保护及攻毒试验  50-52
    2.4 血清溶菌酶(LSZ)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定  52
    2.5 血清抗体水平  52-53
  3 讨论  53-56
第三章 PLGA 为佐剂的 C5a 肽酶纳米疫苗对预防罗非鱼链球菌病的免疫效果研究  56-65
  1 材料和方法  56-58
    1.1 材料  56-57
    1.2 超声乳化法制备纳米粒  57
    1.3 微球载药率和包封率的测定  57
    1.4 载药微球体外释放行为的测定  57
    1.5 罗非鱼的免疫与攻毒试验  57-58
    1.6 免疫罗非鱼血清采集及免疫指标分析  58
    1.7 血清抗体水平的测定  58
    1.8 数据处理  58
  2 结果  58-62
    2.1 微球的形态特征  58
    2.2 微球载药率和包封率的测定  58
    2.3 载药微球体外释放行为的测定  58-59
    2.4 ScpB 蛋白的免疫保护及攻毒试验  59-60
    2.5 血清溶菌酶(LSZ)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定  60-61
    2.6 血清抗体水平  61-62
  3 讨论  62-65
全文总结  65-66
参考文献  66-78
附录  78-81
  附录一缩略词表  78-79
  附录二表达载体 pET32a(+)图谱  79-80
  附录三在读期间发表论文情况  80-81
致谢  81

罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究

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