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黄曲霉毒素B1的生物降解及其在肉鸡生产中的应用研究

作　者: 左瑞雨
导　师: 尹清强
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 黄曲霉毒素B 益生菌 解毒酶 肉鸡 生产性能 基因表达
分类号: S831.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


鉴于霉菌毒素B1(AFB1)的严重污染及其对人类和动物健康的严重危害,采取有效措施对霉菌毒素进行脱毒处理成为函待解决的问题。本文通过筛选得到对黄曲霉菌生长及AFB1降解效果较好的菌株,并对AFB1降解酶进行分离纯化,之后将益生菌与AFB,降解酶配合应用于肉鸡生产中，观察其对肉鸡饲料中AFB1的解毒效果,为其在动物生产中的应用提供依据。(1)通过测定菌丝重量和AFB1产量,筛选对黄曲霉菌生长和产毒抑制效果最好的乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌,并通过正交试验筛选对黄曲霉菌生长和产毒抑制效果最好的益生菌组合。结果显示枯草芽孢杆菌上清液对黄曲霉生长的抑制效果最好,抑制率高达81.87%,乳酸菌上清液抑制产毒效果最好,上清液中AFB1含量仅为4.69μg/L,抑制率高达97.09%。乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌单独培养后以2：1：2的比例混合,对霉菌生长和AFB1产量具有显著抑制作用(P<0.05)。(2)在微生物的液体培养基中添加高浓度的AFB1,通过测定培养液中细胞干重、吸光度值以及pH观察微生物的生长情况,初步判断乳酸菌A2和4株枯草芽孢杆菌均具有较高的AFB1降解能力,其中枯草芽孢杆菌B4的降解率最高,达到38.38%(P≤0.05)。乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌单独培养后以2：1：2的比例混合对AFB1的降解试验中,48h时对AFB1的降解率最高,达到82.72%(P≤0.05)。(3)通过正交试验,研究益生菌组合与酵母细胞壁、寡糖配伍对AFB1的降解作用。研究表明：益生菌组合与酵母细胞壁和寡糖配伍与仅使用益生菌组合对AFB1的降解效果差异不显著(P>0.05),对AFB1的降解率分别为88.30%和85.05%。因而,在后期试验中，仅选择益生菌组合来研究其对AFB1的降解效果。(4)以AFB1作为碳源和能源进行AFB1降解菌株的筛选。筛选得到的细菌和真菌对AFB1的降解率分别为58.04%和77.05%。对降解AFB1的真菌进行固体发酵培养,提取AFB1降解酶粗酶液并通过离子交换层析和凝胶层析,对AFB1降解酶进行分离纯化。通过凝胶层析分离出蛋白分子量约为33.7KDa的AFB1降解酶,对AFB1的降解率达54.33%。经过16S rDNA和26SrDNA的鉴定结果显示,筛选得到的AFB1降解细菌为枯草芽孢杆菌,真菌为米曲霉。(5)鉴于分离纯化后AFB1降解酶的降解效率低于粗酶液,将益生菌组合与AFB1降解酶的粗酶液以不同比例混合,测定其对AFB1的降解能力。结果表明,益生菌组合与AFB1降解酶按2：3的组合比例对AFB1的降解效果最好,对AFB,的降解率达78.07%。(6)将益生菌和AFB1降解酶添加到含有AFB1的饲料中,通过测定肉鸡生产性能、血清和肝脏相关酶活性、抗氧化指标及其相关基因表达量的变化等指标,研究益生菌和AFB1降解酶对肉鸡饲料中AFB1的解毒效果。饲养试验分为前期(1-21d)、中期(22-42d)和后期(43-72d)三个阶段。前期选择1d健康AA肉仔鸡200只,分为5个处理,每个处理5个重复,每个重复8只鸡。中期在前期原处理内选择150只鸡,分为5个重复,每个重复6只鸡。后期选择75只鸡,将各组鸡只混合重新分为5组,每组5个重复,每个重复3只鸡。在前期和中期试验中,A组为基础日粮(对照组),B(负对照组)、C、D和E组分别在基础日粮添加100μg/kg的AFB1,并按照0、0.05%、0.10%和0.15%的比例分别添加益生菌和AFB1降解酶的复合物。在后期试验中，A组为基础日粮(对照组),B、C、D和E组分别在基础日粮添加AFB1量为400、200、400和800μg/kg,除B组不添加益生菌和AFB1降解酶的复合物外(负对照组),C、D和E组分别在基础日粮添加0.15%益生菌和AFB1降解酶。其主要结果如下：在试验前期,与负对照B组相比,添加益生菌和AFB1降解酶的各组肉鸡的末重、平均日增重均有不同程度的提高,死亡率和腹泻率均有显著降低(P≤0.05),其中添加量最大的E组与B组相比,末重和,平均日增重分别提高了11.59%和16.87%(P≤0.05),腹泻率和死亡率分别降低了56.58%和88.89%,且肝脏和法氏囊的重量均有显著提高(P<0.05)。与其它处理组相比,B组粗脂肪和磷代谢率显著降低(P≤0.05)。日粮中添加益生菌和AFB1降解酶显著降低了十二指肠中大肠杆菌的数量(P≤0.05),显著提高了盲肠中乳酸菌的数量(P≤0.05),肌胃、十二指肠、回肠和盲肠中蛋白酶活力皆有显著提高(P≤0.05),血清中间接胆红素、低密度脂蛋白、谷酰转肽酶和总抗氧化能力显著升高(P≤0.05),各处理组基因组DNA无显著变化。总体来看,由于前期基础日粮中AFB1的含量过高,各处理组鸡只的生产性能均受到了严重抑制,但益生菌和AFB1降解酶的解毒效果得到了充分的体现。在试验中期,添加益生菌和AFB.降解酶的各组鸡只除了腹泻率显著降低外(P≤0.05),其它各项生产性能各处理组之间无显著差异(P>0.05)。与其它处理组相比,B组的粗蛋白质代谢率显著降低(P≤0.05)。D和E组全净膛率显著地高于B组(P<0.05)。添加益生菌和AFB1降解酶的各处理组鸡的十二指肠、回肠和盲肠的总细菌数均显著显著高于A和B组(P≤0.05)。与B组相比,日粮中添加益生菌和AFB1降解酶对各处理组鸡回肠淀粉酶活力和盲肠脂肪酶活力皆有显著提高(P≤0.05)。与对照组相比,添加益生菌和AFB1降解酶各组鸡血清中谷草转氨酶的活力皆有显著提高(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶皆有不同程度的下降(P<0.05)；肝脏和胸肌中AFB1含量无显著差异(P>0.05),但B和D组鸡肝脏DNA有部分损伤。在试验后期,添加益生菌和AFB1降解酶显著缓解了AFB1对肉鸡生产性能的抑制。AFB1添加量为200μg/kg的C组,鸡只的末重、平均日增重、平均日采食量和料.肉比显著高于B、D和E组(P≤.05),与对照组无明显的差别(P>0.05)。而未添加益生菌和AFB1降解酶的B组和AFB1添加量达800μg/kg的E组体重则出现了负增长。同等AFB1添加量的B组和D组,因为D组添加了益生菌和AFB1降解酶,其体重、平均日增重、、平均日采食量和料肉比均显著高于B绢,平均日采食量和末重分别提高了23.39%和29.81%(P≤0.05)。与B组相比,其余各组的有机物质、粗蛋白质、钙和磷的代谢率均显著提高(P≤0.05)。随AFB1添加量的增加,显著降低了肉鸡的屠宰性能：但AFB添加量较小的C组,屠宰率、全净膛率、腹脂、脾脏和肌胃的重量与B组相比皆有显著提高(P≤0.05)。各处理组十二指肠的总菌数显著升高(P≤0.05),大肠杆菌数目显著降低(P≤0.05)；十二指肠和回肠淀粉酶活力、肝脏超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总抗氧化能力均有显著提高(P≤0.05)。毒素添加量最大的E组,肝脏基因组DNA损伤严重。总体来看,在AFB.含量为200μ/kg的肉鸡饲料中添加0.15%的益生菌和AFB.降解酶,可以显著缓解AFB1对肉鸡生产性能的不良影响,这为AFBI的生物降解和应用奠定了基础。(7)根据生产性能指标选择43-72d时A、B和D组的公鸡各3只,将肝脏样品等比例混合后进行肝脏中相关基因表达量的测定。结果表明：对于氧化还原酶系来说,A组与B组相比,B组表达量下调的基因占表达量发生变化的基因总数的62.5%：B组与D组相比,D组的大多基因表达量均出现了上调。对于细胞生长酶系来说,B组与D组相比,D组的基因表达量均出现了下调。对于免疫过程控制相关酶系来说,B组与D组相比,D组的基因表达量发生上调和下调的各占50%。对于代谢过程控制相关酶系来说,A组与B组相比,B组的大多基因的表达量均出现了下调,B组与D组相比,D组的大多基因的表达量均出现了上调。对于调节细胞凋亡的基因来说,A组与D组相比,基因表达量均出现了下调,B组与D组相比,D组75%的基因表达量均出现了下调。由此可见,在肉鸡日粮中添加益生菌和AFB1降解酶可显著缓解因添加AFB1所导致的影响生产性能发挥的相关基因表达量发生不良改变的问题,也为今后从基因水平上研究AFB1的致病机制并采取措施缓解其危害奠定了基础。

全文目录


致谢  4-10
摘要  10-13
前言  13-14
第一章 文献综述  14-28
  1 黄曲霉毒素简介  14-16
    1.1 黄曲霉毒素概况  14
    1.2 黄曲霉毒素的理化性质  14
    1.3 黄曲霉毒素的产生  14-15
    1.4 黄曲霉毒素在饲料的污染情况  15
    1.5 黄曲霉毒素的限量标准  15-16
  2 黄曲霉毒素的危害  16-18
    2.1 影响动物机体代谢  17
    2.2 抑制动物生长发育和生产性能的发挥  17-18
  3 黄曲霉毒素的解毒措施  18-19
    3.1 物理方法  18
    3.2 化学方法  18-19
    3.3 生物降解  19
  4 微生物的分离筛选  19-21
    4.1 样品的采集  19
    4.2 微生物的富集培养  19-20
    4.3 微生物的纯种分离  20-21
  5 层析技术在蛋白分离中的应用  21-24
    5.1 层析技术概述  21
    5.2 层析法的分类  21-22
    5.3 凝胶层析在蛋白分离中的应用  22-23
    5.4 离子交换层析在蛋白分离中的应用  23-24
  6 AFB_1生物降解在动物生产中的应用  24-25
  7 基因芯片  25-28
    7.1 基因芯片简介  25
    7.2 基因芯片原理  25
    7.3 基因芯片制备  25-26
    7.4 基因芯片的应用  26-28
第二章 益生菌及其组合对黄曲霉菌生长的抑制作用研究  28-46
  1 材料与方法  28-32
    1.1 试验材料  28
    1.2 试验方法  28-31
    1.3 测定指标  31-32
    1.4 数据处理  32
  2 结果与分析  32-42
    2.1 乳酸菌及其培养液上清液对黄曲霉菌生长的抑制  32-33
    2.2 枯草芽孢杆菌及其培养液上清液对黄曲霉菌生长的抑制  33-34
    2.3 酵母菌培养液及其上清液对黄曲霉菌生长的抑制  34-35
    2.4 乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌培养液上清液对黄曲霉菌株AFB_1产量的影响  35-36
    2.5 益生菌组合对黄曲霉菌生长的抑制及产毒的影响  36-42
  3 讨论  42-44
    3.1 益生菌对黄曲霉菌株生长的抑制  42-43
    3.2 益生菌对黄曲霉菌株产毒的影响  43-44
  4 小结  44-46
第三章 益生菌及其组合对黄曲霉毒素B_1的降解作用研究  46-56
  1 材料与方法  46-48
    1.1 试验材料  46
    1.2 试验方法  46-48
    1.3 测定指标  48
    1.4 数据处理  48
  2 结果与分析  48-52
    2.1 不同培养时间对培养液吸光度值的影响  48-49
    2.2 不同培养时间对培养液细胞干重的影响  49-50
    2.3 不同培养时间对培养液pH的影响  50-51
    2.4 益生菌对AFB_1的降解作用  51
    2.5 不同时间益生菌组合对AFB_1的降解作用研究  51-52
  3 讨论  52-54
    3.1 益生菌对AFB_1的降解作用研究  52-53
    3.2 不同时间益生菌组合对AFB_1的去除作用研究  53-54
  4 小结  54-56
第四章 益生菌组合与酵母细胞壁、寡糖配伍对AFB_1的降解作用研究  56-66
  1 材料与方法  56-58
    1.1 试验材料  56
    1.2 试验方法  56-57
    1.3 测定指标  57-58
    1.4 数据处理  58
  2 结果与分析  58-62
    2.1 酵母细胞壁和寡糖对AFB_1的吸附作用研究  58-59
    2.2 益生菌组合与酵母细胞壁、寡糖配伍对AFB_1的降解作用研究  59-62
  3 讨论  62-64
    3.1 酵母细胞壁和寡糖对AFB_1的去除作用研究  62-63
    3.2 益生菌组合与酵母细胞壁和寡糖配伍对AFB_1的去除作用研究  63-64
  4 小结  64-66
第五章 AFB_1降解菌株的筛选及降解酶的分离纯化  66-84
  1 材料与疗法  66-69
    1.1 试验材料  66
    1.2 试验方法  66-69
    1.3 数据处理  69
  2 结果与分析  69-81
    2.1 AFB_1降解菌株的初筛  69-70
    2.2 AFB_1降解菌株的复筛  70-71
    2.3 AFB_1降解菌株Y8的固体发酵培养  71-72
    2.4 AFB_1降解菌株粗酶液SDS-PAGE蛋白电泳检测  72-73
    2.5 不同方法层析分离AFB_1降解酶后蛋白电泳检测  73-74
    2.6 不同方法层析分离AFB_1降解酶对AFB_1的降解  74-75
    2.7 降解AFB_1菌株的微生物鉴定  75-81
  3 讨论  81-82
    3.1 降解AFB_1微生物的筛选  81
    3.2 降解AFB_1微生物活性物质的分离  81-82
  4 小结  82-84
第六章 益生菌组合与AFB_1降解酶粗酶液配伍对AFB1的降解  84-90
  1 材料与方法  84-86
    1.1 试验材料  84
    1.2 试验方法  84-85
    1.3 测定指标  85-86
    1.4 数据处理  86
  2 结果与分析  86-87
    2.1 不同时间培养液pH测定  86
    2.2 不同时间培养液光密度值的测定  86-87
    2.3 益生菌组合与粗酶液配伍对AFB_1的降解上清液中AFB_1测定  87
  3 讨论  87-88
  4 小结  88-90
第七章 益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡饲料中AFB_1解毒效果的研究  90-134
  1 材料与方法  90-96
    1.1 试验材料  90
    1.2 试验设计与分组  90-91
    1.3 试验日粮  91-93
    1.4 饲养管理  93
    1.5 测定指标及方法  93-96
    1.6 数据分析  96
  2 结果与分析  96-128
    2.1 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡生长性能的影响  96-99
    2.2 日粮中添加益生菌和AFB-1降解酶对肉鸡营养物质代谢率的影响  99-100
    2.3 基础日粮和粪便中AFB_1含量的测定  100-101
    2.4 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡屠宰性能的影响  101-105
    2.5 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡肉品质的影响  105-107
    2.6 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肠道微生物数目的影响  107-109
    2.7 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡肠道淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的影响  109-113
    2.8 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡血清生化指标和相关酶活性的影响  113-117
    2.9 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡血清和肝脏中抗氧化指标的影响  117-118
    2.10 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对鸡肝脏组织的影响  118-121
    2.11 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对鸡血清、肝脏和胸肌中AFB_1含量的影响  121-122
    2.12 AFB_1对肝脏组织DNA的损伤  122
    2.13 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对鸡肝脏中相关基因表达量的影响  122-128
  3 讨论  128-133
    3.1 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡生产性能的影响  128-129
    3.2 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肠道微生物数目的影响  129
    3.3 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肠道酶活性的影响  129-130
    3.4 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶血清生化指标和血清酶活性的影响  130
    3.5 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶肝脏和肾脏组织的影响  130-131
    3.6 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对鸡血清、肝脏和肌肉AFB_1含量的影响  131
    3.7 日粮中添加益生菌和AFB_1降解酶对肉鸡抗氧化能力的影响  131-132
    3.8 利用基因芯片检测AFB_1对肉鸡肝脏中相关基因表达量的影响  132-133
  4 小结  133-134
全文总结  134-136
参考文献  136-144
ABSTRACT  144-148
博士期间发表论文  148

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡 > 饲料与营养
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