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半夏蛋白纯化、表达及其活性研究

作　者: 周炜
导　师: 徐涛
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 半夏胰蛋白酶抑制剂半夏凝集素纯化分泌表达抗肿瘤
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

半夏(Pinellia ternata (Thunb.) Breit)为天南星科半夏属植物，以块茎入药，是一种传统中药，主要成分有蛋白、多糖、生物碱和有机酸等。半夏块茎有燥湿化痰、散结、降逆止呕等功效。研究表明半夏块茎具有抗早孕、抗肿瘤、抗虫、抗病毒、抗真菌、抗心律失常、促有丝分裂、降血脂和凝血等作用。半夏蛋白主要由半夏胰蛋白酶抑制剂和半夏凝集素组成。植物蛋白酶抑制剂和凝集素具备多种生物学功能活性，目前商业应用已经很广泛。本研究设计单步Trypsin-Sepharose4B亲和柱层析法来亲和分离纯化半夏胰蛋白酶抑制剂(Pinellia ternata tryspin inhibitor，PTTI)。通过半夏块茎组织匀浆、水提、硫酸铵梯度沉淀和Trypsin-Sepharose4B亲和柱吸附及洗脱，得到一种新的蛋白酶抑制剂。SDS-PAGE显示纯化的半夏蛋白酶抑制的分子量为20kDa左右，应属于植物Kunitz型植物蛋白酶抑制剂。利用猪胰脏胰蛋白酶作为反应酶，BAPNA作为酶反应底物，得到纯化的半夏蛋白酶抑制剂的抑制比活力为366.5±14.57U/mg，纯化倍数为8.6倍。硫酸-苯酚法测得该蛋白的多糖含量为12.84±0.64%，表明从半夏块茎中的分离得到的半夏抑制剂蛋白是一种糖蛋白。稳定性实验表明该抑制剂对温度和pH都相对稳定。半夏凝集素(Pinellia ternata agglutinin，PTA)是一种单子叶甘露糖结合型植物凝集素，是四个亚基组成的同源二聚体。本研究利用Mannose-Sepharose4B亲和柱建立一种新的植物凝集素分离方法，通过优化亲和分离条件，高通量纯化得到半夏凝集素PTA。通过半夏块茎组织匀浆、浸泡过夜、硫酸铵沉淀和离心，得到半夏总蛋白。半夏总蛋白分别溶于10%，15%，20%，25%和30%不同质量分数的NaCl溶液中处理，随后不同浓度NaCl溶液中的蛋白样品上样到Mannose-Sepharose4B亲和柱中用以吸附PTA，淋洗掉未结合的杂蛋白后，将PBS通入Mannose-Sepharose4B亲和柱中，发现可通过降低亲和柱中缓冲液的盐离子浓度从而将亲和吸附的PTA洗脱下来。含量测定表明当半夏总蛋白用25%NaCl溶液处理后可获得最大的纯化得率，为35.5mg/g半夏块茎。SDS-PAGE显示该方法分离得到的PTA分子量为12kDa左右且纯度很高，约97%。凝血实验表明PTA浓度为6μg/mL时可以明显凝集小鼠血细胞。本研究建立一种新的植物凝集素单步分离方法，不仅可用于甘露糖凝集素的分离，也可用于其他植物凝集素的分离。该方法与传统的植物凝集素分离方法相比，比如离子柱层析、凝胶过滤和猪甲状腺球蛋白亲和层析法，具有纯化得率高、产物纯度高、操作过程简单、经济花费少和产物无污染等特点，具有良好的工业应用前景。信号肽APSP可引导目的肽链穿过细胞内膜进入内膜与外膜的周质空间内，然后该信号肽序列被信号肽裂解酶特异性切除，获得末端保真性肽链，在一系列生化酶的作用下，重组肽链可形成二硫键并且正确折叠。本研究通过PTA的结构信息，以pta基因为模板，设计特异PCR引物，克隆得到编码半夏凝集素N端结构域肽链基因pta-n。根据大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽核酸序列apsp，设计PCR引物，通过三步PCR法，将apsp核酸序列融合到pta-n的5’端，获得融合目的基因apsp-pta-n，以期实现PTA-N的分泌性表达。该目的基因经过限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，产物片段与表达质粒酶连，构建得到重组表达质粒pET-28a-apsp-pta-n并转入到表达菌株E. coli BL21(DE3)获得工程菌株。该工程菌株经过IPTG诱导表达、超声波破碎与离心，获得细胞破碎上清液。Ni-NTA亲和柱用于重组蛋白PTA-N的纯化，SDS-PAGE用于证实目的蛋白的诱导表达与纯化结果。SDS-PAGE表明该目的蛋白可以可溶性表达并被Ni-NTA亲和柱纯化，纯化得率约为20mg/L。凝血与抑制实验表明PTA-N (6μg/mL)能凝结小鼠血细胞。抗真菌实验显示PTA-N对小麦赤霉菌Gibberella saubinetii具有生长抑制作用。抗肿瘤实验MTT法表明PTA-N对多种肿瘤细胞系有生长抑制作用，进一步的Hochest33342核染色和DNA片段化分析表明PTA-N处理人类肝癌肿瘤细胞Bel-7404后可形成凋亡典型的凋亡小体和梯状化核酸片段。这些结果证明PTA-N通过诱导Bel-7404发生凋亡而发挥抗肿瘤活性，这些结果也表明重组表达的PTA-N具有与天然PTA相似的生理功能。本研究根据PTA晶体结构信息，通过碱性磷酸酶信号肽与目的蛋白融合，构建分泌表达体系，实现半夏甘露糖结合凝集素在原核表达系统中的可溶性表达，为其他植物凝集素的表达提供一定参考。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
缩略语  13-18
第一章文献综述  18-41
  1.1 植物凝集素  18-26
    1.1.1 植物凝集素的发现  18
    1.1.2 植物凝集素的定义  18-19
    1.1.3 植物凝集素的分类  19-20
    1.1.4 植物凝集素的结构  20-21
    1.1.5 植物凝集素的分离纯化  21-22
    1.1.6 植物凝集素的生物活性  22-25
      1.1.6.1 抗昆虫作用  22-23
      1.1.6.2 抗真菌作用  23
      1.1.6.3 抗肿瘤作用  23-24
      1.1.6.4 抗病毒作用  24
      1.1.6.5 生物固氮作用  24-25
    1.1.7 植物凝集素的应用  25-26
  1.2 植物蛋白酶抑制剂  26-28
    1.2.1 植物蛋白酶抑制剂简介  26
    1.2.2 植物蛋白酶抑制剂的分类  26
    1.2.3 植物蛋白酶抑制剂的应用  26-28
  1.3 半夏凝集素  28-35
    1.3.1 半夏简介  28
    1.3.2 半夏块茎成分研究  28-30
      1.3.2.1 半夏多糖  28-29
      1.3.2.2 生物碱  29
      1.3.2.3 氨基酸类  29
      1.3.2.4 半夏蛋白  29-30
      1.3.2.5 有机酸类  30
      1.3.2.6 挥发油类  30
    1.3.3 半夏凝集素的发现  30-31
    1.3.4 半夏凝集素生理活性  31
    1.3.5 半夏凝集素晶体结构  31-33
    1.3.6 半夏凝集素的克隆表达研究进展  33-34
    1.3.7 半夏凝集素转基因植物研究  34-35
  1.4 大肠杆菌可溶性表达外源蛋白策略  35-39
    1.4.1 大肠杆菌表达系统特点  35-36
    1.4.2 可溶性表达策略  36-39
      1.4.2.1 培养条件的优化  36-37
      1.4.2.2 分泌表达  37
      1.4.2.3 信号肽结构与功能  37-38
      1.4.2.4 分泌途径  38-39
  1.5 本研究的目的与研究内容  39-41
    1.5.1 研究目的  39-40
    1.5.2 研究内容  40-41
第二章半夏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化  41-51
  前言  41
  2.1 材料与试剂  41-42
    2.1.1 实验材料  41
    2.1.2 主要仪器  41
    2.1.3 主要试剂的配制  41-42
  2.2 实验方法步骤  42-45
    2.2.1 半夏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化  42-43
    2.2.2 SDS-PAGE 凝胶电泳检测  43-44
    2.2.3 Native-PAGE 电泳检测  44
    2.2.4 半夏胰蛋白酶抑制剂活力测定  44
    2.2.5 PTTI 多糖含量测定  44-45
    2.2.6 热稳定性与酸碱稳定性分析  45
  2.3 实验结果与讨论  45-50
    2.3.1 实验结果  45-48
      2.3.1.1 硫酸铵沉淀结果  45-46
      2.3.1.2 亲和纯化分离结果  46-47
      2.3.1.3 多糖含量测定的标准曲线  47
      2.3.1.4 PTTI 抑制活力测定结果  47
      2.3.1.5 热稳定性与酸碱稳定性  47-48
    2.3.2 讨论  48-50
  2.4 本章小结  50-51
第三章半夏凝集素纯化条件的优化  51-60
  前言  51
  3.1 实验材料和试剂  51-52
    3.1.1 实验材料  51
    3.1.2 主要仪器  51-52
    3.1.3 主要试剂的配制  52
  3.2 实验方法  52-54
    3.2.1 硫酸铵沉淀总蛋白  52-53
    3.2.2 Mannose-Sepharose 4B 亲和层析  53
    3.2.3 凝血活性检测  53-54
  3.3 实验结果  54-57
    3.3.1 硫酸铵沉淀  54
    3.3.2 亲和纯化条件优化  54-55
    3.3.3 不同纯化方法的比较  55-56
    3.3.4 凝血活性  56-57
  3.4 讨论  57-59
  3.5 本章小结  59-60
第四章半夏凝集素 PTA-N 的可溶表达与活性鉴定  60-85
  前言  60-61
  4.1 实验材料和主要试剂  61-62
    4.1.1 实验材料  61
    4.1.2 主要试剂的配制  61-62
  4.2 实验方法  62-71
    4.2.1 重组蛋白 rPTA-N 的获得  62-69
      4.2.1.1 引物序列设计  62
      4.2.1.2 半夏凝集素 N 端结构域 pta-n 基因的克隆  62-65
      4.2.1.3 载体片段的获得  65
      4.2.1.4 apsp-pta-n 与 pET-28a 酶连  65-66
      4.2.1.5 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞  66
      4.2.1.6 重组子的转化与鉴定  66-67
      4.2.1.7 重组工程菌的获得  67
      4.2.1.8 目的蛋白的诱导表达  67-68
      4.2.1.9 目的蛋白 rPTA-N 的分离纯化  68-69
    4.2.2 重组 rPTA-N 的活性鉴定  69-71
      4.2.2.1 凝血活性分析  69
      4.2.2.2 抗真菌活性分析  69
      4.2.2.3 抗肿瘤活性分析  69-70
      4.2.2.4 凋亡 Hochest33342 核染色检测  70
      4.2.2.5 DNA 片段化检测细胞凋亡  70-71
  4.3 结果  71-79
    4.3.1 融合基因 apsp-pta-n 的融合与扩增  71-72
    4.3.2 重组质粒的 PCR 与双酶切鉴定  72-73
    4.3.3 目的蛋白的诱导表达与纯化  73-74
    4.3.4 凝血活性分析  74-75
    4.3.5 抗真菌活力分析  75
    4.3.6 抗肿瘤活性分析  75-76
    4.3.7 肿瘤细胞形态学观察结果  76-77
    4.3.8 Hochest 33342 核染色结果  77-78
    4.3.9 DNA 片段化分析结果  78-79
  4.4 讨论  79-84
    4.4.1 目的基因 apsp-pta-n 的融合与表达  79-81
    4.4.2 重组 rPTA-N 与天然 PTA 的活性  81-84
  4.5 本章小结  84-85
总结与展望  85-87
参考文献  87-94
攻读硕士期间的研究成果  94-96
致谢  96

半夏蛋白纯化、表达及其活性研究

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