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洋葱假单胞菌S31脂肪酶的分离提取及其在食品中应用

作　者: 夏胜华
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 洋葱假单胞菌脂肪酶分离纯化 L-抗坏血酸脂肪酸酯固定化
分类号: TS201.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一类重要的甘油酯键水解酶,广泛存在于动物、植物各种组织及微生物中,可以在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换等反应。目前,脂肪酶是重要的工业酶制剂之一,广泛应用于生物能源(生物柴油合成)、油脂加工以及医药等行业。洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶为位置非特异性脂肪酶,可以提高脂肪酶水解及转酯反应的效率。本文主要通过对洋葱假单胞菌S31脂肪酶的发酵生产、酶的分离提取进行了研究,同时对洋葱假单胞菌S31脂肪酶在小麦粉中及催化合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的应用展开了较深入的研究,并对洋葱假单胞菌S31脂肪酶固定化进行初探,为脂肪酶的应用提供理论依据。主要研究内容如下：1.洋葱假单胞菌S31脂肪酶的分离提取。采用膜过滤、硫酸铵分级沉淀、冷冻干燥等手段分离提取洋葱假单胞菌S31脂肪酶。结果表明,脂肪酶比活力由153.2UmL/mg提高到1203.9UmL/mg,纯化倍数为7.858,回收率为43.92%。2.洋葱假单胞菌S31脂肪酶在小麦粉中应用。小麦粉中不同水平脂肪酶添加量结果表明,脂肪酶水解小麦粉中三油酸甘油酯,转换成单油酸甘油酯与油酸；在添加量为0.5U/g时,类胡萝卜素含量为0.49μg/g,较对照组降低108.97%；脂肪酶添加量为0.4 U/g时,面筋蛋白和非面筋蛋白的-SH含量分别达到最低,为17.36molμ/10g与6.87μmol/10g;添加量为0.3 U/g,小麦粉非面筋蛋白与面筋蛋白-S-S-含量达到最大值,分别为8.56μmol/10g与14.89μmol/10g。球蛋白、醇溶蛋白与麦谷蛋白的提取量在脂肪酶添加量分别为0.3 U/g、0.4U/g、0.2 U/g时达到最大值,为15.48μg/g、13.32μg/g、31.24μg/g；在脂肪酶添加量为0.3U/g时,面团硬度弹性、咀嚼度最大值。3.洋葱假单胞菌S31脂肪酶催化合成L-抗坏血酸脂肪酸酯研究。通过对加酶量、反应介质、反应温度、底物摩尔比对脂肪酶催化反应的影响研究,确定了最佳的反应条件：有机反应介质为叔丁醇,猪油与L-抗坏血酸的摩尔比为3:1、酶用量为300U、温度为50℃,转化率可达到31.24%。在单因素实验的前期研究基础上,选择酶量、温度、底物摩尔比、反应时间4因素等关键因子,采用响应曲面法进行优化。结果表明,当加酶量327U、温度49.3℃、底物比3.14、反应时间29.7h时,在此优化条件下,L-抗坏血酸脂肪酸酯得率为40.69%,验证试验结果表明,Vc脂肪酸酯的转化率为39.86%,与理论预测值吻合,证明这一模型是有效的。与单因子实验相比提高了近10个百分点。4.洋葱假单胞菌S31脂肪酶固定化初探。通过对吸附介质,给酶量,pH、吸附时间、吸附温度、戊二醛浓度以及交联时间对酶的固定化影响研究。结果表明,吸附载体大孔树脂DM130、给酶量为493U/0.5g、pH7.5、吸附时间8h、吸附温度25℃、戊二醛浓度为0.05%和交联时间为2h。固定化脂肪酶催化合成L-抗坏血酸脂肪酸酯转化率为23.53%。

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表格索引 8-9图形索引 9-11摘要 11-13ABSTRACT 13-15第一章文献综述 15-33 1 微生物脂肪酶的生产 15-16 2 脂肪酶的分离纯化 16-19 2.1 膜分离技术 18 2.2 双水相萃取技术 18 2.3 反胶团萃取 18-19 3 微生物脂肪酶的催化特性 19-20 3.1 微生物脂肪酶的最适作用条件及稳定性 19 3.2 脂肪酸专一性 19-20 3.3 位置特异性 20 3.4 立体特异性 20 4 酶的固定化 20-23 4.1 吸附法 21 4.2 共价结合法 21 4.3 交联法 21-22 4.4 包埋法 22-23 5 脂肪酶在食品加工中的应用 23-26 5.1 脂肪酶在面类食品加工中的作用 23 5.2 脂肪酶在食品添加剂工业中的应用 23 5.3 脂肪酶在食用油脂工业上的应用 23-25 5.3.1 酶促油脂水解 24 5.3.2 酶促酯交换 24 5.3.3 生物精炼—酶促酯化 24-25 5.4 脂肪酶在乳品工业中的应用 25 5.5 在食品废料处理中的应用 25-26 6 本研究的目的意义及内容 26-27 参考文献 27-33第二章洋葱假单胞菌S31脂肪酶的分离提取 33-42 1 材料和方法 33-36 1.1 材料 33-34 1.1.1 菌种 33 1.1.2 培养基 33-34 1.1.3 试剂 34 1.1.4 主要仪器设备 34 1.2 方法 34-36 1.2.1 种子培养 34 1.2.2 摇瓶发酵 34 1.2.3 脂肪酶活力测定 34-35 1.2.4 蛋白质含量测定 35 1.2.5 离心 35 1.2.6 膜过滤 35 1.2.7 硫酸铵沉淀 35-36 1.2.8 透析脱盐 36 1.2.9 冷冻干燥 36 2 结果与分析 36-39 2.1 脂肪酶酶活标准曲线 36-37 2.2 蛋白质含量标准曲线 37 2.3 膜过滤 37 2.4 硫酸铵沉淀脂肪酶 37-38 2.5 提取及纯化各步回收率 38-39 3 讨论 39-40 4 小结 40-41 参考文献 41-42第三章洋葱假单胞菌S31脂肪酶在小麦粉中应用研究 42-55 1 材料与方法 42-46 1.1 材料 42-43 1.1.1 试验样品 42 1.1.2 主要试剂 42 1.1.3 主要仪器和设备 42-43 1.2 方法 43-46 1.2.1 面团配方制作与取样 43 1.2.2 面团中脂质的提取 43 1.2.3 薄层层析法检测脂肪酶对面团内脂质的水解作用 43-44 1.2.4 面团中类胡萝卜素的测定 44 1.2.5 面团面筋蛋白和非面筋蛋白中-SH含量的测定 44-45 1.2.6 面团中面筋蛋白和非面筋蛋白中被还原抑制的-S-S-的含量测定 45 1.2.7 蛋白质各组分的提取 45-46 1.2.8 面团的质构性质测定 46 2 结果与分析 46-52 2.1 脂肪酶对面团中脂质的提取 46-47 2.2 脂肪酶对面团中类胡萝卜素的影响 47-48 2.3 脂肪酶对面筋蛋白和非面筋蛋白内-SH含量的影响 48 2.4 脂肪酶对面筋蛋白和非面筋蛋白内-S-S-的还原抑制 48-49 2.5 脂肪酶对面团中不同蛋白组分提取的影响 49-51 2.6 脂肪酶对面团质构性质的影响 51-52 3 讨论 52-53 4 小结 53-54 参考文献 54-55第四章洋葱假单胞菌S31脂肪酶合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的研究 55-71 1 材料与方法 55-58 1.1 材料 55 1.2 酶的最适温度和热稳定性 55-56 1.3 脂肪酶有机溶剂的耐受性 56 1.4 L-抗坏血酸脂肪酸酯的合成 56 1.5 响应面实验设计 56 1.6 L-抗坏血酸脂肪酸酯的HPLC分析 56-57 1.7 L-抗坏血酸脂肪酸酯的标准曲线 57-58 2 结果与分析 58-67 2.1 S31脂肪酶对有机溶剂的耐受性及反应体系对转化率的影响 58-59 2.2 S31脂肪酶最适温度、热稳定性及温度对转化率的影响 59-61 2.3 酶量的筛选 61 2.4 猪油与L-抗坏血酸摩尔比筛选 61-62 2.5 反应时间对转化率的影响 62-63 2.6 响应曲面实验 63-67 2.6.1 反应参数的分析 65-66 2.6.2 响应因子水平的优化 66-67 2.6.3 验证性试验 67 3 讨论 67-68 4 小结 68-69 参考文献 69-71第五章洋葱假单胞菌S31脂肪酶的固定化初探 71-83 1 材料与方法 71-73 1.1 材料 71-72 1.1.1 固定化载体 71-72 1.1.2 药品与试剂 72 1.2 方法 72-73 1.2.1 大孔树脂预处理 72 1.2.2 树脂载体的选择 72 1.2.3 酶量等的筛选 72-73 2 结果与分析 73-78 2.1 固定脂肪酶的大孔树脂筛选 73 2.2 酶量的选择 73-74 2.3 时间对脂肪酶固定化的影响 74-75 2.4 pH对脂肪酶固定化的影响 75-76 2.5 温度对脂肪酶固定化的影响 76 2.6 戊二醛浓度对脂肪酶固定化的影响 76-77 2.7 交联时间对脂肪酶固定化的影响 77-78 2.8 固定化脂肪酶的稳定性 78 3 讨论 78-79 4 小结 79-80 参考文献 80-83全文结论 83-85论文创新点 85-87致谢 87

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