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芥菜型油菜TT8干扰载体的构建及遗传转化

作　者: 袁玉辉
导　师: 刘忠松
学　校: 湖南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 芥菜型油菜黄籽 TT8 遗传转化下胚轴
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 2次
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内容摘要

油菜作为世界四大油料作物之一,其种皮颜色不仅是一个形态指示性状,而且与种子休眠有关,还关系到油菜的品质[1]。本研究以芥菜型油菜品种四川黄籽、Brown mustard的下胚轴为外植体,利用农杆菌介导法进行遗传转化,研究了外植体在愈伤诱导、芽分化及生根培养三阶段的激素和硝酸银配比对转化的影响,以期建立芥菜型油菜高效遗传转化体系。同时,本研究以TT8基因为研究对象,构建了含TT8基因的干扰载体,通过芥菜型油菜近等基因系A转基因试验分析TT8基因的功能,以期为选育黄籽高油分高品质油菜品种奠定基础。试验结果如下：1、优化了以下胚轴为外植体的农杆菌介导的芥菜型油菜遗传转化体系。在基本培养基的基础上通过添加lmg/L2,4-D预培养、3mg/L6-BA+5mg/L AgNO3芽分化、2.5mg/L IBA+0.05mg/L NAA生根效果最佳。下胚轴的出愈率、出芽率和生根率分别达到100%、28.33%和100%。经PCR和GUS染色检测,阳性率达到23.80%,说明体系高效可行。2、通过酶切、连接等分子克隆技术,将TT8整合到pfGC5941载体中,成功构建干扰载体pRNAi-TT8。3、遗传转化芥菜型油菜近等基因系A,获得15株阳性植株,阳性率为38.46%,其中有10株成功收获种子。T1代种籽粒色比CK颜色稍浅且饱满度下降,说明TT8基因参与芥菜型油菜种皮原花色素的合成,但其参与机理还有待进一步研究。特异性PCR检测T1代植株幼叶DNA,表明外源基因TT8发生了不同程度的分离,转基因后代生长稳定,外源基因能稳定遗传。转基因T1代植株正在结荚中,待收获T2代种子进行表型鉴定及相关化合物的含量分析。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-11
第一章文献综述  11-18
  1 黄籽油菜的研究进展  11-16
    1.1 黄籽油菜的来源途径及存在问题  11-12
    1.2 黄籽油菜形成机理的研究  12
    1.3 油菜种皮颜色相关基因的研究  12-13
    1.4 TT8研究进展  13-14
    1.5 植物基因功能的研究方法  14-16
      1.5.1 基因功能增加突变  14-15
      1.5.2 基因功能缺失突变  15-16
  2 农杆菌介导的油菜遗传转化  16-17
  3 存在问题与展望  17
  4 本研究的目的与意义  17-18
第二章激素配比和硝酸银对芥菜型油菜下胚轴再生植株的影响  18-29
  1 材料与方法  18-23
    1.1 材料  18-20
      1.1.1 菌株与质粒  18
      1.1.2 植物材料  18
      1.1.3 主要仪器设备  18
      1.1.4 主要药品试剂  18-20
    1.2 方法  20-23
      1.2.1 外植体的获取  20
      1.2.2 预培养  20-21
      1.2.3 农杆菌的培养  21
      1.2.4 外植体与农杆菌的共培养  21
      1.2.5 脱菌与分化培养  21-22
      1.2.6 生根培养  22
      1.2.7 PCR检测  22
      1.2.8 GUS染色检测  22-23
      1.2.9 数据统计与分析  23
  2 结果与分析  23-27
    2.1 预培养基中激素配比对四川黄籽愈伤诱导的影响  23-24
    2.2 分化培养基中6-BA浓度对芽再生的影响  24-25
      2.2.1 6-BA浓度对四川黄籽下胚轴芽再生的影响  24-25
      2.2.2 6-BA浓度对Brown mustard下胚轴芽再生的影响  25
    2.3 AgNO_3浓度对芽再生的影响  25-26
      2.3.1 AgNO_3浓度对四川黄籽下胚轴芽再生芽再生的影响  25-26
      2.3.2 AgNO_3浓度对Brown mustard下胚轴芽再生的影响  26
    2.4 生根培养基中激素配比对根再生的影响  26-27
    2.5 再生抗性苗的检测  27
  3 讨论  27-29
第三章 TT8片段的克隆与RNAi载体的构建  29-39
  1 材料与方法  29-34
    1.1 材料  29
      1.1.1 植物材料  29
      1.1.2 菌株与质粒  29
      1.1.3 药品与试剂  29
      1.1.4 仪器设备  29
    1.2 试验方法  29-34
      1.2.1 油菜总RNA的提取  29-30
      1.2.2 cDNA合成  30
      1.2.3 TT8基因干扰片段的PCR扩增  30-31
      1.2.4 PCR产物回收  31
      1.2.5 PCR产物的测序与对比  31
      1.2.6 干扰载体的构建  31-32
      1.2.7 大肠杆菌的制备及转化  32-34
  2 结果与分析  34-38
    2.1 TT8目的序列克隆与PCR扩增检测  34
    2.2 TT8基因测序结果的同源性比对分析  34-36
    2.3 芥菜型油菜TT8基因干扰载体的构建及验证  36-38
    2.4 扰载体转化根癌农杆菌的质粒PCR验证  38
  3 讨论  38-39
第四章芥菜型油菜近等基因系A(NILA)干扰载体目BjTT8的遗传转化  39-46
  1 材料与方法  39-42
    1.1 材料  39-40
      1.1.1 菌株与质粒  39
      1.1.2 植物材料  39
      1.1.3 主要仪器设备  39
      1.1.4 主要药品试剂  39-40
    1.2 方法  40-42
      1.2.1 无菌外植体的获取  40
      1.2.2 农杆菌的培养  40
      1.2.3 外植体与农杆菌的共培养  40
      1.2.4 脱菌与分化培养  40
      1.2.5 筛选分化及生根移栽  40-41
      1.2.6 转化植株目的基因的鉴定  41-42
  2 结果与分析  42-45
    2.1 芥菜型油菜转干扰BjTT8基因Y_0代植株的PCR鉴定  42
    2.2 芥菜型油菜转干扰BjTT8基因T_0代植株形态特征观察  42
    2.3 芥菜型油菜转干扰BjTT8基因T_0代植株种籽特征观察  42-43
    2.4 芥菜型油菜转干扰BjTT8基因T_1代植株的PCR鉴定  43-44
    2.5 芥菜型油菜转干扰BjTT8基因T_1代植株形态特征观察  44
    2.6 芥菜型油菜转干扰BjTT8基因T_1代植株种籽特征观察  44-45
  3 讨论  45-46
第五章结论与讨论  46-49
  1 结论  46
  2 讨论  46-49
    2.1 农杆菌介导的芥菜型油菜遗传转化体系应用前景  46
    2.2 转基因后代的遗传规律  46-47
    2.3 BjTT8参与决定调控芥菜型油菜的粒色等多种种籽性状  47-48
    2.4 对油菜种皮颜色调控基因工程下一步工作的展望  48-49
参考文献  49-54
缩写表  54-55
致谢  55-56
作者简介  56

芥菜型油菜TT8干扰载体的构建及遗传转化

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