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龙眼多糖的流变性、结构鉴定及其清除自由基活性研究

作　者: 查春节
导　师: 罗勇悦
学　校: 华中农业大学
专　业: 食品工程
关键词: 龙眼多糖纯化流变性结构鉴定活性
分类号: TS201.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

龙眼(Dimocarpus longan lour.)属于无患子科(Sapindaceae)龙眼属(Dinocarpus Lour.)植物,原产于中国,同荔枝、香蕉、菠萝同为华南四大珍果。古书中曾记载益智宁心,养血安神,长智敛汗,开胃益脾,润肺止咳等,还能治产后浮肿,气虚水肿,脾虚泄泻,被视为药食两用的珍宝。但是龙眼不耐贮存,易变干、褐变或因滋生微生物而导致果实腐烂,导致货架期变短。且龙眼以鲜食为主,用于加工制成产品的龙眼占总量比例不到30%。加之产量的大幅增加与贮藏、运输和市场方面的制约,龙眼产业经济效益的提升受到制约。有必要从加强龙眼有效活性成分的研究,探索其活性成分与结构的关系,其生理或药理机理等方面着手以提高龙眼龙眼生物利用度,从而实现一条开发龙眼药用与保健深加工产品的科学道路。近年来,对龙眼功能性因子的研究越来越受到人们的关注,其中,龙眼多糖是龙眼中的一种生理活性物质,有抗氧化活性,免疫调控和改善记忆力的作用,以及抗肿瘤、抑制酪氨酸酶活性和糖基化反应等生理功能。因此,龙眼多糖成为人们研究龙眼功能性因子的焦点之一。本课题以龙眼果肉为实验材料,综合应用食品科学、天然产物化学、食品化学等现代研究方法学理论和分析化学、仪器分析等现代研究技术手段,分离纯化了龙眼多糖,并对该多糖的分子量、结构、流变特性以及清除自由基活性等进行研究。主要研究内容和结论概括如下：1、研究了龙眼多糖含量的测定方法,通过对传统苯酚-硫酸法和两种改进的苯酚-硫酸法测定龙眼多糖的精密度、重现性和回收率进行比较分析后,结果显示：三种方法的精密度都较好,其中,改良的苯酚-硫酸法的RSD是0.88%,比传统法和定糖法分别小0.83%和1.24%；改良法和硫酸-苯酚定糖法的重现性较优,RSD分别是3.16%和3.96%；三种方法的回收率没有显著差异。因此,本课题中采用改良苯酚-硫酸法测定龙眼中多糖含量,所测得龙眼多糖含量为14.64%。2、本文中以龙眼干果肉(湿基含水量12.94%)为材料,采用热水浸提提取龙眼多糖,提取条件为：温度90℃,料液比1：4,提取时间2h,提取次数3次。经Sevag法除蛋白,5次后已基本无残留蛋白。用过氧化氢法除色后,龙眼多糖溶液从浑浊褐色变成了澄清的淡黄色溶液。经除蛋白、脱色、透析以及浓缩冻干后的龙眼多糖即是龙眼精制多糖LP,2.5Kg干龙眼肉可提取出精制多糖7.44g。接着,研究了龙眼多糖的纯化工艺以及完成了纯度鉴定和分子量测定工作。精制多糖LP经DEAE-纤维素52柱层析纯化得三个组分LPA、LPB、LPC,得率分别是8.35%,62.36%,11.36%。得率最高的LPB经Sephacryl S-400柱纯化后得到多糖组分LPB-2-M,经过GPC鉴定后为均一纯化多糖。同时,HPGPC法测得LPB-2-M重均分子量Mw为8.0×104g·moL-1,分子量的分布范围在2.7×104g·moL-1与4.1×105g·moL-1之间,而分子量在8.4×104g· moL-1以内的多糖占90%左右,分散系数D=1.03。3、通过一系列理化性质实验表明,龙眼粗多糖CLP呈褐色,部分水溶,精制龙眼多糖LP和纯化龙眼多糖LPB-2-M均能完全溶于水,前者呈淡黄色蓬松状,后者为无色粉末；茚三酮反应表明CLP中含有少量蛋白质,而LP和LPB-2-M中几乎没有残留蛋白；硫酸-咔唑反应表明CLP、LP和LPB-2-M都含有糖醛酸；碘-碘化钾反应表明龙眼多糖中不含淀粉类物质。热分析显示,龙眼多糖LPB-2-M具有两次明显的失重过程,第一个失重峰出现在70℃左右,失重率为10.85%,第二个失重峰出现在226.7℃～276.5℃,失重率是38.77%,总体失重率是49.62%,说明龙眼多糖热稳定性良好,在230℃以下不易热分解。4.初步研究了龙眼多糖流变类型以及浓度、pH、蔗糖、Na+和Ca2+的添加对其流变性的影响。通过稳态剪切实验和小振幅动态剪切实验结果表明：龙眼多糖溶液有剪切稀释现象,是非牛顿流体(亦称假塑性流体)；龙眼多糖溶液浓度大于3%时,主要呈现弹性行为；pH变化对其表观粘度影响非常明显,尤其是在碱性中大大降低,且影响是不可逆的；蔗糖、Na+和Ca2+的添加对龙眼多糖溶液的表观粘度增加和粘弹性行为的影响有促进作用,且与蔗糖和Ca2+的添加量有一定浓度依赖性；但蔗糖、Na+和Ca2+并不会改变流体的类型。结合分析稳态剪切测试和小振幅动态剪切测试结果表明：龙眼多糖溶液不符合Cox-Merz规则。5.采用紫外-可见分光光度计、高效液相色谱、红外光谱、核磁共振波谱、高碘酸氧化等手段初步分析了龙眼多糖LPB-2-M的结构。经苯酚-硫酸法测定粗多糖CLP、精制多糖LP和LPB-2-M含糖量分别为35.26%,47.42%和84.32%；硫酸-咔唑法测得糖醛酸含量分别是0.17%,6.27%和7.61%；考马斯亮蓝法测得CLP中蛋白含量为2.1%,LP和LPB-2-M中几乎没有残留蛋白。LPB-2-M单糖组成有核糖,鼠李糖,果糖,葡萄糖,阿拉伯糖,半乳糖,木糖以及半乳糖醛酸；异头碳为β-型居多,α-型非常少,是含有1→6键型,也可能含有1→2,1→4键型的分支较多的酸性杂多糖。6.通过DPPH自由基清除实验、ABTs自由基清除实验、羟基自由基清除实验,研究了龙眼多糖清除体外自由基的活性。龙眼多糖的活性由大到小依次是ABTs自由基清除活性：>DPPH自由基清除活性>羟自由基清除活性。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
第一章绪论  11-27
  1 引言  11-12
  2 龙眼及龙眼多糖研究概况  12-16
    2.1 龙眼的营养价值  12
    2.2 龙眼的分布  12
    2.3 龙眼多糖研究进展  12-16
  3 多糖研究进展  16-25
    3.1 多糖生物活性  17-19
    3.2 多糖的分析方法  19-25
  4 本课题立题背景、研究意义与主要内容  25-27
    4.1 立题背景与研究意义  25-26
    4.2 本课题主要研究内容  26-27
第二章龙眼多糖的分离纯化与理化性质  27-52
  1 引言  27
  2 实验材料与仪器  27-28
    2.1 材料与试剂  27-28
    2.2 仪器与设备  28
  3 实验方法  28-36
    3.1 提取  28-29
    3.2 提取流程图  29
    3.3 除蛋白  29-30
    3.4 除色  30
    3.5 透析  30
    3.6 DEAE-纤维素层析柱纯化  30-31
    3.7 Sehacryxl S-400 HR柱纯化  31-32
    3.8 龙眼多糖含量的测定方法  32-34
    3.9 纯度鉴定与分子量测定  34
    3.10 碘-碘化钾反应  34
    3.11 茚三酮反应  34-35
    3.12 Molish反应  35
    3.13 苯酚-硫酸反应  35
    3.14 硫酸-咔唑反应  35
    3.15 流变测试  35-36
    3.16 热稳定性测定  36
  4 结果与讨论  36-50
    4.1 三种测定方法的精密度比较  36
    4.2 三种方法的准确性比较  36-37
    4.3 三种方法的重现性比较  37-38
    4.4 龙眼多糖的分离纯化结果分析  38-41
    4.5 纯度鉴定与分子量测定结果  41-42
    4.6 龙眼多糖基本理化性质  42
    4.7 龙眼多糖的流变特性  42-49
    4.8 龙眼多糖的热稳定性  49-50
  5 本章小结  50-52
第三章龙眼多糖的组成与初步结构鉴定  52-61
  1 引言  52
  2 材料与设备  52-53
    2.1 材料与试剂  52-53
    2.2 仪器与设备  53
  3 实验方法  53-56
    3.1 蛋白含量测定  53-54
    3.2 糖醛酸含量测定  54
    3.3 PMP柱前衍生化HPLC测定单糖组成  54-55
    3.4 红外光谱分析  55
    3.5 高碘酸氧化  55-56
  4 结果与讨论  56-60
    4.1 龙眼多糖中的主要组成成分  56
    4.2 龙眼多糖的单糖组成  56-58
    4.3 龙眼多糖的IR分析  58
    4.4 高碘酸氧化  58-59
    4.5 ~1H-NMR分析  59-60
  5 本章小结  60-61
第四章龙眼多糖清除自由基的活性  61-66
  1 引言  61
  2 实验材料与设备  61-62
    2.1 材料与试剂  61
    2.2 仪器与设备  61-62
  3 实验方法  62-63
    3.1 DPPH自由基清除实验  62
    3.2 ABTs自由基清除实验  62
    3.3 羟基自由基清除实验  62-63
  4 结果与讨论  63-65
    4.1 清除DPPH自由基活性  63-64
    4.2 清除ABTs自由基活性  64-65
    4.3 清除羟自由基活性  65
  5 本章小结  65-66
第五章结论与展望  66-69
  1 结论  66-67
  2 创新点  67-68
  3 进一步研究设想  68-69
参考文献  69-74
致谢  74-75
硕士期间论文发表情况  75

龙眼多糖的流变性、结构鉴定及其清除自由基活性研究

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