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PPV/HN-2011毒株分子生物学特性研究及利用杆状病毒表达其VP2蛋白

作　者: 苌生科
导　师: 张许科
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪细小病毒系统发育进化杆状病毒表达系统 VP2蛋白表达免疫原性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 23次
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内容摘要

猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起猪群繁殖障碍的重要病原之一，母猪感染PPV的典型临床繁殖障碍特征是返情、流产、木乃伊胎和死胎，此外，PPV可以增强猪圆环病毒2型的临床症状，也是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(porcine postweaing mulisystemic wastingsyndome，PMWS)的病原之一。本论文针对PPV HN-2011毒株的NS1与VP2基因进行系统进化分析，利用表达系统的学位论文">杆状病毒表达系统表达PPV的VP2蛋白，并进行VP2蛋白的抗原特征分析，其目的是为了了解PPVHN-2011毒株的遗传背景信息，并比较PPV传统灭活疫苗与重组VP2亚单位疫苗的免疫效果。试验一：猪细小病毒HN-2011全基因组测序及生物信息学分析通过设计涵盖PPV基因组的5对引物，分段克隆PPV的基因片段，将PCR鉴定为阳性的重组质粒送大连宝生物工程公司测序。结果表明HN-2011株序列长为4773nt，其编码区均不存在碱基的插入与缺失，ORF2编码VP1和VP2下游存在一个127-bp重复。将中国河南PPV HN-2011毒株的基因组序列与GenBank收录的的PPV的NS1和VP2基因序列进行了分析表明，PPV分离株可以划分为4组，中国的PPV主要集中在A和B两组，只有一个JY株存在于C组；PPV基因组的压力选择分析显示出，NS1和VP2基因分别受到负向和正向的选择；PPV VP2蛋白3维结构显示：几乎上所有的氨基酸变异的多态性位点主要集中在病毒衣壳蛋白的表面。实验二：猪细小病毒VP2基因在重组杆状病毒中的表达及抗原特性分析首先利用PCR扩增VP2基因，将VP2基因转入杆状病毒转移载体pFastBacI中，构建重组的质粒pFastbac-VP2，再将该重组质粒转入DH10Bac感受态细胞中，并获得重组杆状病毒。将得到的重组杆状病毒接种昆虫细胞，通过SDS-PAGE、IFA、Western blot和血凝性鉴定VP2蛋白的表达。将得到的VP2蛋白与MONTANIDE ISA206佐剂乳化后，免疫8周龄豚鼠，采用血凝抑制的方法对疫苗的免疫效果进行评价。结果显示，VP2亚单位疫苗与HN-2011灭活苗及商品化灭活疫苗相比，抗体水平上升较快且高于传统灭活疫苗。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
文献综述  9-19
  猪细小病毒  9
  1 病原学  9-14
    1.1 PPV 分类地位  9
    1.2 PPV 的生物物理及生物化学  9-10
    1.3 PPV 基因组结构及病毒的复制  10-11
    1.4 PPV 的转录  11-12
    1.5 PPV 编码的蛋白  12-13
    1.6 PPV 分型  13-14
    1.7 血凝性  14
  2 流行病学  14
  3 临床症状及病理变化  14-15
  4 诊断  15-16
    4.1 病毒的分离  15
    4.2 血清学检测方法  15-16
      4.2.1 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验  15
      4.2.2 血清中和试验(SN)  15-16
      4.2.3 ELISA 试验  16
      4.2.4 乳胶凝集试验(1atex agglutination test，LAT)  16
    4.3 PCR 检测 PPV  16
    4.4 LAMP 诊断 PPV  16
  5 PPV 的防治  16-18
    5.1 PPV 目前并没有有效的治疗办法，主要的综合防治措施：  16-17
    5.2 PPV 疫苗  17-18
      5.2.1 弱毒疫苗  17
      5.2.2 灭活疫苗  17
      5.2.3 基因工程疫苗  17-18
  6 本研究的目的与意义  18-19
实验 1：PPV HN2011 毒株全基因组的测序及其序列分析  19-31
  摘要  19
  1 材料与方法  19-25
    1.1 材料  19-20
      1.1.1 细胞及毒株  19
      1.1.2 主要试剂和酶  19
      1.1.3 主要仪器  19-20
    1.2 引物设计  20
    1.3 PPV DNA 模板的提取  20
    1.4 猪细小病毒全基因序列的分段扩增  20-21
      1.4.1 按下列组份配制 PCR 反应液  20
      1.4.2 反应程序  20-21
      1.4.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳  21
    1.5 PCR 产物胶回收  21-22
    1.6 PPV 全基因组各片段的克隆  22-23
      1.6.1 载体与插入片段连接  22
      1.6.2 转化  22
      1.6.3 质粒提取  22-23
    1.7 重组子测序  23
    1.8 PPV HN2011 分离株核苷酸序列测定及分析  23-25
  2 实验结果  25-29
    2.1 PPV 基因组各片段的克隆、鉴定及序列测定  25
      2.1.1 PPV 基因组各片段的扩增结果  25
      2.1.2 各个阳性克隆测序及其序列拼接结果  25
    2.2 PPV NS1 与 VP2 基因核苷酸序列分析  25-26
    2.3 非结构蛋白 NS1 及结构蛋白 VP2 氨基酸压力选择性分析  26-27
    2.4 国内外 PPV NS1 和 VP2 基因系统发育和分型结果比较  27-28
    2.5 VP2 衣壳蛋白氨基酸残基分子特征分析  28-29
  3 讨论  29-31
实验 2：杆状病毒表系统表达 PPV VP2 蛋白及 VP2 蛋白的免疫原性研究  31-44
  摘要  31
  1 材料与方法  31-38
    1.1 材料  31
      1.1.1 载体与菌种及细胞  31
      1.1.2 主要试剂  31
    1.2 方法  31-38
      1.2.1 VP2 基因的克隆  31-32
      1.2.2 酶切鉴定阳性重组载体  32
      1.2.3 PPV VP2 基因与目的载体 pFastbacⅠ连接鉴定  32
      1.2.4 重组 Bacmid DNA 的获得  32-33
      1.2.5 提取 PPVVP2Bacmid 重组杆状病毒  33
      1.2.6 Sf9 细胞培养  33-34
      1.2.7 重组阳性杆粒 PPVVP2Bacmid 转染 Sf9 细胞  34
      1.2.8 间接免疫荧光实验验证 Sf9 细胞表达 PPV VP2 蛋白  34-35
      1.2.9 SDSPAGE 电泳与 Westernblot 验证 PPV VP2 的表达  35-36
      1.2.10 Sf9 细胞表达的 VP2 蛋白血凝试验  36
      1.2.11 PPV 阳性血清及 PPV 单克隆抗体对 Sf9 细胞表达的 VP2 蛋白的血凝抑制试验  36-37
      1.2.12 重组杆状病毒及其表达的 VP2 蛋白形成 VLPs 的透射电镜观察  37
      1.2.13 动物实验  37-38
  2 实验结果  38-43
    2.1 PCR 扩增 VP2 基因  38-39
    2.2 VP2 与 T 载体酶切鉴定  39
    2.3 pFastbac1PPVVP2 载体酶切验证  39
    2.4 重组 PPVVP2Bacmid 的 PCR 鉴定  39-40
    2.5 PPVVP2Bacmid 转染 Sf9 细胞病变  40
    2.6 间接免疫荧光法检测昆虫细胞表达的 VP2 蛋白  40
    2.7 PPVVP2 蛋白 SDSPAGE 电泳  40-41
    2.8 PPVVP2 蛋白 WesternBlot 鉴定  41
    2.9 PPV 阳性血清及 PPV 单克隆抗体对 Sf9 细胞表达的 VP2 蛋白的 HI 实验  41-42
    2.10 重组杆状病毒及其表达的 VP2 蛋白形成 VLPs 的透射电镜观察  42-43
    2.11 动物实验结果  43
  3 讨论  43-44
全文总结  44-45
参考文献  45-50
ABSTRACT  50-52
附录  52-55

PPV/HN-2011毒株分子生物学特性研究及利用杆状病毒表达其VP2蛋白

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