|
动物及临床研究证实,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)治疗缺血性疾病是有效的。目前普遍认为,MSC的治疗作用与其旁分泌多种可溶性生物活性分子有关。真核细胞在凋亡时可释放膜微粒(Microparticles,MPs),其可作为细胞间生物信号及信息交换的载体,将携带的生物活性物质和表面受体转移至选定的靶细胞,从而调整靶细胞的生物学功能。本实验分离培养人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSC),并从细胞形态、分化功能以及表型给予鉴定。然后通过低氧低营养培养诱导脐带间充质干细胞凋亡(模拟MSC治疗缺血性疾病时发生的凋亡),从条件培养液中获取MPs。再以大鼠肢体缺血模型为研究对象,观察MPs对缺血区血管新生的影响。最后,通过研究MP对脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)增殖、迁移、管状结构形成能力的影响,初步探讨MPs促血管新生的机制。分离培养UCMSC,进行成脂、成骨诱导分化；流式检测CD29、 CD31、CD44、CD45、CD73等表面标志表达情况。低氧低营养条件培养诱导其凋亡,流式检测诱导不同时间(1d、2d、3d、4d)细胞凋亡率,获取早期凋亡率高,晚期凋亡率低的培养条件,应用4℃真空以10000g的转速离心1h条件培养液,收集沉淀,通过流式检测AnnexinV及细胞表型表达情况,透射电子显微镜观察其形态,BCA法测定蛋白浓度,从而建立制备MPs确切的实验方法。其次,通过结扎大鼠右侧股动脉建立肢体缺血模型,以UCMSC、Buffer为对照,在结扎股动脉第2d将MPs及对照液接种于缺血区,14d后进行激光多普勒灌注成像检测组织供血情况；并制作肌肉组织石蜡切片,H&E染色切片方法评价肌肉组织萎缩情况,CD31免疫组化染色检测骨骼肌微血管密度；最后,以HUVEC为研究对象,应用DiI标记UCMSC制备携带DiI荧光的MPs与HUVEC共培养,检测不同时间对HUVEC的感染率,来明确MPs与HUVEC的作用方式；为探讨MPs促血管新生的机制,实验以DMEM、10%FBS、10ng·mL-1bFGF为对照,通过流式检测细胞增殖指数、Transwell迁移及体外管状结构形成的测定方法,评价MPs对HUVEC体外增殖、迁移及成管状能力的影响。结果成功分离培养出成纤维状贴壁细胞,可向成脂成骨分化,并且CD29、CD44、CD73阳性表达,而CD31,CD45表达阴性,符合首届胎盘来源干细胞国际细胞治疗协会关于MSC的最低标准；低氧低营养培养UCMSC随培养时间的延长,早期凋亡逐步增多,但培养至第4d,晚期凋亡明显增多,为避免晚期凋亡细胞释放凋亡小体污染MPs,故选择条件培养3d的培养液制备MPs,通过流式鉴定其大小约为0.15μm,其表面标志与亲本细胞表达一致,并且Annexin V表达阳性,透射电子显微镜观察其大小约80nm-150nm,符合MPs的基本定义,通过BCA法测出蛋白浓度约为1mg·mL-1。通过结扎右侧大鼠股动脉后,LDPI检测右侧血流灌注比左侧降低了56.92%,在缺血区分别接种Buffer、MSC、MPs14d后,右侧缺血肢体血流恢复MPs组明显优于Buffer及MSC组；取病理标本H&E染色发现,Buffer组肌细胞明显萎缩,并可见大量炎性细胞浸润,MPs及MSC组肌细胞同正常组一样排列紧密,未见明显炎性细胞浸润；通过CD31免疫组化染色检测缺血区肌肉微血管的密度,MPs组明显高于Buffer、正常组(P<0.01),略高于MSC组。流式检测DiI对UCMSC感染率在99%左右,制备携带Dil的MPs与HUVEC共培养,作用4h及8h对HUVEC的感染率分别为46.64%及86.55%左右；MPs组对HUVEC的促增殖作用明显优于其他各组(P<0.01)；对HUVEC的迁移及成管状结构能力明显优于DMEM及FBS组(P<0.01),略高于bFGF组,但无统计学意义。结果表明从人脐带中可获取符合MSC标准的UCMSC,并可通过低氧低营养诱导其凋亡,可获取符合MPs定义的MSC-MPs,该方法制备的MPs与MSC移植一样,具有促进缺血肢体血管新生及组织修复的能力,并通过MSC-MPs促进HUVEC的增殖、迁移及管状结构形成提供了有利的证据。以期为MSC探索一种新的治疗机制,即由以往旁分泌机制转入一种非细胞、带膜微粒的机制。
|