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hsBAFF通过Ca²⁺-CaMKII依赖抑制PP2A激活Erk1/2导致B细胞增殖机理研究

作　者: 梁丁芳
导　师: 陈龙
学　校: 南京师范大学
专　业: 生理学
关键词: hsBAFF B细胞 Ca2+ CaMKⅡ PP2A Erk1/2 增殖
分类号: Q25
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究运用RAN干扰、Western bloting、细胞培养、流式细胞仪等细胞学分子生物学技术,通过在体、离体实验,研究了PP2A活性与Erkl/2信号转导在hsBAFF激活B淋巴细胞增殖中的作用；通过使用钙离子螯合剂或CaMKII抑制剂,进一步探讨了hsBAFF上调B淋巴细胞[Ca2+]i与PP2A活性表现以及Erkl/2激活的关系,本研究旨在为理解BAFF调节体液免疫机制和相关疾病的防治提供理论基础和科学依据。结果如下：1hsBAFF通过抑制PP2A激活Erk1/2促进B细胞增殖在体小鼠实验,选取40只ICR健康小鼠,雌雄各半,随机分成对照组和4个不同剂量hsBAFF处理组,每组8只。处理组每日按照含hsBAFF0.1、0.5、1和2mg/kg体重的PBS溶液进行腹腔注射,对照组注射同等剂量的PBS溶液。在注射8天后,用抗CD19磁珠分离纯化脾脏B淋巴细胞。离体细胞实验,分别接种6、24或96孔培养板的Raji细胞和／或分离纯化原代B淋巴细胞,用0-5μg/ml hsBAFF处理12或48h、或用2.5μg/ml hsBAFF处理0-24h。以上实验分析细胞增殖活性、PP2A和Erkl/2蛋白表达变化。采用Ad-MKK1-R4F、Ad-MKK-K97M感染Raji细胞分别持续激活或钝化MKK活性,或用Ad-PP2A-wt感染Raji细胞过表达PP2A,论证PP2A-Erk1/2信号级联在hsBAFF促进B细胞增殖中的作用。结果显示：hsBAFF注射小鼠8天后,脾脏B淋巴细胞增殖活性呈现剂量依赖性升高,并且可见PP2A去甲基化和磷酸化及Erk1/2磷酸化也呈hsBAFF剂量依赖增加。离体实验显示,hsBAFF促进B细胞增殖与其抑制PP2A活性导致Erk1/2磷酸化增加有密切关系。这被持续激活MKK1强化hsBAFF诱导Erk1/2磷酸化和B细胞增殖作用,而钝化MKK1使得hsBAFF诱导Erkl/2磷酸化和增殖减弱,以及PP2A过表达部分地阻止hsBAFF激活Erkl/2和B细胞增殖证据支持。提示：hsBAFF通过抑制PP2A激活Erk1/2进B细胞增殖。2bsBAFF通过Ca2+-CaMKII依赖抑制PP2A诱导Erkl/2激活和B细胞增殖将培养的Raji细胞接种于6或24孔培养板,在1和2.5μg/ml hsBAFF单独作用及与抑制剂联合作用12h或48h,各种抑制剂BAPTA/AM、EGTA、2-APB或KN93在加hsBAFF前预处理1h。Western blot检测PP2A活性和Erk1/2激活状态、细胞计数评估B细胞增殖表现。结果显示：BAPTA/AM, EGTA或2-APB削弱hsBAFF抑制PP2A活性,进而降低Erkl/2磷酸化和B细胞增殖,表明hsBAFF抑制PP2A激活Erkl/2和B细胞增殖是Ca2+依赖的。CaMKⅡ抑制剂KN93通过削弱hsBAFF诱导PP2A活性抑制明显阻止Erkl/2磷酸化和B细胞增殖,表明hsBAFF刺激CaMKII抑制PP2A激活Erkl/2和B细胞增殖。本研究提示：hsBAFF通过Ca2+-CaMKⅡ依赖抑制PP2A诱导Erkl/2激活和B细胞增殖。

全文目录

摘要  7-9
Summary  9-11
引言  11-12
第一部分文献综述  12-27
  第一章 PP2A调控Erk1/2通路与免疫细胞增殖的关系  13-20
    1 PP2A与免疫细胞增殖的关系  13-15
      1.1 PP2A的结构与功能  13-14
      1.2 PP2A对淋巴细胞增殖的调节作用  14
      1.3 PP2A与免疫疾病关系  14-15
    2 Erk1/2信号通路与淋巴细胞增殖  15
    3 PP2A信号通路与Erk1/2信号通路  15-16
    参考文献  16-20
  第二章 Ca~(2+)信号在淋巴细胞及其相关免疫疾病发生中的作用  20-27
    1 淋巴细胞中的钙稳态  20
    2 淋巴细胞钙流机制  20-21
      2.1 钙内流机制  20-21
      2.2 淋巴细胞钙释放机制  21
    3 Ca~(2+)在淋巴细胞中的传导效应  21-22
      3.1 Ca~(2+)瞬时效应  21-22
      3.2 Ca~(2+)长时效应  22
    4 钙离子与免疫缺陷病的关系  22-23
      4.1 Ca~(2+)信号与系统性红斑狼疮(SLE)发生的关系  22
      4.2 Ca~(2+)信号与WHIH综合症发生的关系  22-23
      4.3 Ca~(2+)信号与伴性淋巴增殖病(XLP)发生的关系  23
      4.4 Ca~(2+)信号与重度联合免疫缺陷病(SCID)发生的关系  23
    5 Ca~(2+)/CaMKⅡ与PP2A及Erk1/2通路的关系  23-24
      5.1 Ca~(2+)信号与PP2A及Erk1/2信号通路相关联  23
      5.2 CaMKⅡ与免疫细胞的关系  23-24
    参考文献  24-27
第二部分实验研究  27-50
  第三章 hsBAFF通过抑制PP2A激活Erk1/2促进B细胞增殖  28-41
    摘要  28-29
    1 材料与方法  29-31
      1.1 主要药品与试剂  29
      1.2 实验动物  29
      1.3 Raji细胞的培养  29
      1.4 小鼠脾脏细胞的分离及培养  29-30
      1.5 活细胞数量流式分析  30
      1.6 腺病毒的构建和感染细胞  30
      1.7 细胞增殖分析  30-31
      1.8 免疫印迹(Western blot)  31
      1.9 数据处理  31
    2 结果  31-36
      2.1 hsBAFF抑制小鼠脾脏B淋巴细胞PP2A活性、Erk1/2激活和细胞增殖  31-32
      2.2 hsBAFF促进B细胞增殖  32
      2.3 hsBAFF抑制PP2A导致Erk1/2通路激活  32
      2.4 持续激活或钝化MKK1影响hsBAFF激活Erk1/2和B细胞增殖  32
      2.5 过表达的PP2A抑制hsBAFF激活B细胞Erk1/2和增殖  32-36
    3 讨论  36-37
    参考文献  37-39
    Abstract  39-41
  第四章 hsBAFF通过Ca~(2+)-CaMKⅡ依赖抑制PP2A诱导Erk1/2激活和B细胞增殖  41-50
    摘要  41-42
    1 材料与方法  42-43
      1.1 主要药品与试剂  42
      1.2 Raji细胞培养  42
      1.3 细胞计数增殖分析  42
      1.4 免疫印迹(Western blot)分析  42-43
      1.5 数据处理  43
    2 结果  43-46
      2.1 BAPTA/AM削弱hsBAFF抑制PP2A依赖的Erk1/2激活和B细胞增殖  43-44
      2.2 EGTA、2-APB阻止hsBAFF抑制PP2A依赖的Erk1/2激活和B细胞增殖  44-45
      2.3 KN93阻断hsBAFF抑制PP2A依赖的Erk1/2激活和B细胞增殖  45-46
    3 讨论  46-47
    参考文献  47-49
    Abstract  49-50
第三部分全文结论  50-52
附1  52-53
致谢  53-54

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