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骨关节炎软骨下骨重建中成骨细胞增殖与凋亡的机制

作　者: 李庆涛
导　师: 欧阳钧；邱小忠
学　校: 南方医科大学
专　业: 人体解剖学
关键词: 骨关节炎成骨细胞凋亡蛋白质芯片 PGE2 p21
分类号: R684.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景：骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种常见的关节疾病,以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。最近研究表明软骨下骨的病变在骨关节炎的发病过程中起主要作用。软骨下骨病变主要包括硬化、骨赘形成和骨小梁稀疏变窄,其中骨硬化和骨赘形成主要由成骨细胞完成,而骨小梁数目变少、间隙增宽主要由破骨细胞完成。OA软骨下骨病变焦点是成骨细胞增殖和凋亡异常,且较正常成骨细胞分泌大量细胞因子和活性物质。因此阐明成骨细胞增殖与凋亡的调控机制,对阐明软骨下骨的病变机制,对提出新的OA治疗措施有极大帮助。成人的骨转化和骨重建过程中成骨细胞主要作用是合成骨质,在完成转化或重建后,可分化为骨衬细胞、骨细胞或发生凋亡从体内消失。软骨下骨中新生成骨细胞由骨髓间充质迁移而来,与凋亡消失的细胞成一定数量比例。成骨细胞增殖和凋亡是维持成骨细胞数目的和功能稳定关键环节。而成骨细胞的增殖和凋亡受基因的严格调控,并受体内多种因素的调节。但目前对成骨细胞在软骨下骨中迁移、增殖、分化和凋亡过程中存在的调控机制尚不清楚。OA过程中软骨细胞发生大量凋亡已被证实,细胞凋亡过程受多种凋亡基因严密调控。细胞凋亡发生时细胞产生大量细胞凋亡因子,但受制于凋亡检测技术,过去研究每次只能针对几个因子进行研究,但调控网络涉及众多因子,因此到目前详细的凋亡调控机制仍不清楚。OA中成骨细胞不断发生凋亡,并在软骨下骨硬化病变中起到重要作用。但由于成骨细胞处于骨组织内对其凋亡的检测受到极大的限制。如何高效、准确地检测软骨和软骨下骨中的细胞凋亡是目前OA研究中亟待解决的问题。近年,蛋白质组学飞速发展,检测蛋白质的技术越来越先进。上世纪出现的蛋白芯片技术在蛋白质研究领域中展现出其强大功能。抗体芯片是蛋白质芯片的一种,根据抗体抗原的特异性反应原理,可同时检测多种蛋白质,且操作简便,具有极高的灵敏性。目前已出现多种可直接完成对血液、尿液、细胞裂解液中细胞因子检测的抗体芯片。当今先进的芯片技术为疾病相关分子的发现、疾病的分子诊断和治疗药物的开发提供高效快捷的研究手段。目前还没有出现针对OA研究的芯片,如何采用目前的抗体芯片技术来认识和解决OA中细胞凋亡问题,值得我们积极探索。前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)在体内外具有强大的骨代谢调节作用。PGE2可通过细胞表面的4种特异性受体作用于成骨细胞和破骨细胞,产生显著的骨形成和骨吸收效果。OA患者的软骨下骨中成骨细胞分泌PGE2量存在差异,可分为高低两类,代表了两种不同类型OA。在高OA病人,其成骨细胞分泌大量PGE2,软骨下骨较低OA组和正常软骨下骨硬化程度高,提示OA软骨下骨中PGE2的含量与成骨细胞的功能状态,增殖和凋亡的调控都有密切关系。但PGE2对成骨细胞增殖和凋亡的具体调控机制仍不清楚。p21又称p21WAF1/CIPl是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子,与细胞的增殖、分化和凋亡具有密切关系。p21在成骨细胞增殖与凋亡调控中具有重要作用,但PGE2对成骨细胞的p21作用如何目前未有报道。HSP27是热休克蛋白sHSP亚家族中的重要一员,保护细胞免受各种应激因素的损伤,并参与细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导调节,诱导型HSP27主要在细胞受到高温、紫外线、药物等刺激下大量表达,调节细胞凋亡的关键信号通路。目的：采用可同时检测43种凋亡相关蛋白的人类细胞凋亡因子抗体芯片对人OA关节软骨和软骨下骨组织进行分析。探讨OA软骨和软骨下骨中细胞凋亡因子的变化,以进一步了解细胞凋亡与OA发生、发展的关系。研究PGE2对成骨细胞增殖和凋亡的调控作用与p21的关系,为阐明OA软骨下骨病变提供实验依据。方法：1.采用RayBio(?)公司研发的人类细胞凋亡因子抗体芯片检测技术。关节软骨和软骨下骨组织取自全关节置换OA病人的膝关节,正常对照关节取自外伤截肢患者。液氮研磨提取关节软骨、软骨下骨总蛋白,芯片检测严格按操作说明进行,室温下封闭30min,加样品蛋白稀释液置4°恒温摇床孵育过夜,次日加一抗室温孵育2h,漂洗3次,加HRP-二抗室温孵育1.5h,漂洗3次,化学发光法检测,激光扫描仪扫描X胶片,图像由RayBio(?)图像软件分析,数据组间比较采用独立样本t检验,P值<0.05,为差别有统计学意义。2.10umol/LPGE2处理MC3T3-E1成骨细胞30min,2h,4h。对照组不处理。提取各组细胞RNA,通过Real-time PCR检测各组细胞p21、HSP27 mRNA的变化。提取各组细胞总蛋白,western blot检测p21、HSP27蛋白表达的变化。结果：1.采用人凋亡因子抗体芯片对OA软骨和软骨下骨进行分析并与正常关节的做比较发现,正常软骨和OA软骨的芯片膜检测位点全部表达,阳性对照位点明显,阴性对照位点未有信号。OA软骨中共有38种凋亡因子较正常组表达显著增高(P值均<0.05),包括bad、bax、bcl-2、p53、caspase-3等。OA软骨中BID表达显著下调(P=0.002)。CD40、FasL等4种因子表达变化不显著(P值均>0.05)。软骨下骨的检测发现所有芯片上的位点都有显影,OA组与正常组比较只有9种凋亡因子显著变化(P值均<0.05),其余因子变化不显著(P值均>005)。2.采用10umol/L PGE2处理MC3T3-E1成骨细胞30min,2h,4h后。采用Real-time PCR法检测p21和HSP27 mRNA, western blot检测p21和HSP27蛋白发现,p21 mRNA和蛋白量随时间增加表达增高,在2h时达高峰。HSP27 mRNA、蛋白在处理后2h呈一过性高表达。结论：采用人类细胞凋亡因子抗体芯片对软骨和软骨下骨组织进行检测,观察到有大量凋亡因子发生显著变化,凋亡在OA过程中具有重要意义。芯片技术在OA研究中具有良好前景。PGE2对成骨细胞增殖和凋亡的调控作用与p21基因的表达有密切关系,PGE2可促进p21表达而抑制成骨细胞增殖。PGE2作用于成骨细胞可促进HSP27一过性高表达。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-18
  一、骨关节炎研究现状  13
  二、软骨下骨在骨关节炎发病中的作用  13-14
  三、OA软骨下骨中的成骨细胞异常  14-15
  参考文献  15-18
第一章抗体芯片分析OA软骨和软骨下骨细胞凋亡因子的表达变化  18-32
  1. 引言  18-19
  2. 材料和方法  19-21
  3. 结果  21-26
  4. 讨论  26-28
  5. 结论  28-29
  参考文献  29-32
第二章 PGE_2对MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡的调控机制  32-50
  1. 引言  32-33
  2. 材料和方法  33-39
  3. 结果  39-44
  4. 讨论  44-46
  5. 结论  46
  参考文献  46-50
全文小结  50-51
中英文缩略词表  51-52
致谢  52-54
统计学审稿证明  54

骨关节炎软骨下骨重建中成骨细胞增殖与凋亡的机制

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