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弱精子症患者精子中CRISP2基因及其蛋白产物的初步研究

作　者: 景晓玮
导　师: 毛向明；冯春琼
学　校: 南方医科大学
专　业: 泌尿外科
关键词: 精子 CRISP2 弱精子症基因芯片生物信息学
分类号: R698.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

不孕不育是全世界关注的研究课题。目前,不孕不育的发病率有逐年上升的趋势。有统计研究表明在不孕不育中夫妇中由男方因素导致的已上升到了50%。而近来有研究显示,在因不孕不育而就诊的夫妇中,由于男性因素所导致的不育提高到了2/3。对于由男性因素所导致的不育的临床研究表明,男性精子活力低下是其主要的因素之一,临床称之为弱精子症。临床导致弱精子症病因众多,其中包括感染、精液液化异常、免疫因素、内分泌因素、Kartagener’s综合征、染色体异常、精索静脉曲张以及微量元素缺乏和不良生活习惯等因素。正是由于弱精症病因众多,发病机制尚不明确,所以临床无法采取有效的、针对性的治疗措施,其治疗效果也不令人满意,很多不孕不育夫妇最终只能选择人工辅助生殖。有研究发现,在一份正常的精液样本中,在低活力精子中一些基因的表达明显低于高活力精子。一些基因(如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11)也已被证实与弱精子症的发生有关。上述这些研究表明精子中某些基因mRNA的表达水平的差异是与弱精子症发生、发展是密切相关的。为了能更好的揭示这一现象,前期我们采用基因芯片技术对弱精子症基因表达谱进行了研究,并从中筛选获得部分弱精子症差异表达基因。按照基因表达上调或下调2倍以上并且两组样本t检验p<0.05的筛选标准,在含有41000个基因的芯片中,芯片检测数据经GeneSpring10.0表达谱分析软件分析,共获得1265个弱精子症特异表达基因,其中307个基因在弱精子症组中表达上调,958个基因在弱精子症组中表达下调(Log2Ratio≤1或Log2Ratio≥1 P<0.05)。但基因芯片作为一种高效、大规模地获取生物信息的技术,其所筛选所产生的海量数据中势必存在部分假阳性。而生物信息学作为近些年崛起的一门通过综合利用生物学、计算机科学和信息技术的新兴学科,它为从海量数据中去伪存真进行挖掘数据提供了一种有效手段。本研究利用生物信息学工具对前期芯片筛查结果进行深入挖掘,从中发掘出与弱精子症相关基因,并对其进行深入研究,阐述其与成年男性弱精子症发生、发展的关系。本研究的主要研究方法、内容和结论包括以下几个方面：第1部分基于生物信息学弱精子症相关基因挖掘目的：运用多种生物信息学工具对前期基因芯片筛查所得弱精子症差异表达基因(共获得的1265个弱精子症特异表达基因,其中307个基因在弱精子症实验组中表达上调,958个基因在弱精子症实验组中表达下调)进行深入发掘,从中筛选出与弱精子症密切相关的弱精子症特异表达基因,并对其生物学功能以及与弱精子症发生、发展关系进行深入研究。方法：1.将前期基因芯片检测数据经GeneSpring10.0表达谱分析软件分析所得的1265个弱精子症特异表达基因,其中307个基因在弱精子症实验组中表达上调,958个基因在弱精子症实验组中表达下调(Log2Ratio≤或Log2Ratio≥1 P<0.05)。分别导入在线分析软件GATHER、PANTHER以及ToppGene。2.运用上述生物信息学软件对上述差异基因进行生物信息学分析挖掘,对其功能进行功能分析以及信号转导通路分析。结果：1.差异基因GATHER分析将弱精子症特异表达基因上传导入GATHER在线软件进行分析,软件共计可识别基因1205个。对差异基因进行GO分类分析发现,差异基因主要与细胞生理过程和物质新陈代谢有关,如G蛋白偶联的信号转导通路、细胞蛋白质／大分子物质新陈代谢有关；2.差异基因PANTHER分析将弱精子症特异表达基因导入PANTHER在线分析软件,共计有932个基因可被识别,通过软件分析结果发现,可被识别的差异基因pathway分析发现在整合素信号转导通路、白介素信号转导通路、过氧化应激反应、TGF-β信号转导通路以及凋亡信号转导通路是上调的,而在肾上腺素／去甲肾上腺素合成、5-羟色胺合成、bZIP转录因子转录调节、组胺合成通路是下调的。3. ToppGene分析分别将在弱精子症中上调表达差异基因307个、下调表达差异基因958个上传导入ToppGene进行在线功能分析。上调基因中共有234个可被识别,下调基因中共有663个可被识别。经过软件对差异基因参与生物学分析发现,在弱精子症中上调表达的差异基因主要与细胞免疫应答、抗原识别与呈递、细胞死亡、凋亡以及介导细胞程序化死亡有关。而下调表达基因则主要与蛋白水解、细胞蛋白质大分子物质代谢、修饰相关的蛋白质及大分子物质代谢、蛋白K48泛素化过程以及微管细胞骨架构成有关。结论：1.通过生物信息学挖掘发现弱精子症精子在活力下降的同时,精子的基本生命活动也下降,同时更易于发生凋亡、死亡。2.参与细胞骨架构成、微管运动、细胞运动的一些差异表达基因,如KIF3B、MYO15A、KIF6、KIF26B、KIF3A、DNHD2、DMN、DYNC2H1、STARD9、MYOHD1、TPM1等,可能与弱精子症相关,值得进一步深入研究。3.结合文献挖掘发现CRISP2基因及其表达产物与弱精子症密切相关,值得进一步深入研究第2部分弱精子症患者精子中CRISP2基因及蛋白初步研究目的：结合前期芯片筛查、生物信息学工具挖掘以及文献挖掘,发现CRISP2基因及其蛋白质表达产物与弱精子症密切相关。通过实验探讨弱精子症患者精子中CRISP2基因(富含半胱氨酸的分泌蛋白2)mRNA及蛋白的表达水平,探讨其与精子活力的关系及相关的分子机制。方法：1.收集成年男性弱精子症患者精液77例,活力正常精液67例作为对照组。采用50% Percoll离心分离纯化后,-80℃保存；2.将收集的精子标本从-80℃冰箱中取出,37℃水浴箱解冻,每四份合为一份,采用RNeasy mini kit提取精子RNA。采用转录酶-聚合酶链式反应(Real Time-PCR), SYBR Green荧光实时定量PCR技术检测CRISP2 mRNA表达量；3.冻存标本解冻后,采用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白,免疫印迹(Western Blot)检测蛋白相对表达量。4. CRISP2蛋白STRING分析,将CRISP2蛋白名上传至STRING数据库(网址http://string-db.org/),对与CRISP2蛋白相关蛋白及其之间相互作用进行分析。5.进一步结合文献挖掘对CRISP2基因及其蛋白表达产物进行深入研究。结果：1. CRISP2基因在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量,下调达4.3倍；2. Western Blot(?)发现CRISP2蛋白在弱精子症组较正常对照组下调约1.71倍,两组之间的表达量有明显的统计学差异(P<0.05)。3. STRING分析提示CRISP2蛋白与GRSF1、GGN、TPX2、SPATA22、MAP3K11、NSUN4、PGK2、SPZ1、LDHC、LUZP4等蛋白存在相互作用。结论：1. CRISP2基因除通过Wnt信号转导通路参与精子发育调节,还通过RyR受体信号转导通路,影响精子Ca2+通道的活性,其蛋白类表达产物直接参与精子尾部重要细胞骨架结构构。2. CRISP2基因以及蛋白的表达水平与精子活力密切关系。弱精子症患者精子中CRISP2基因mRNAs及蛋白表达下调可能与精子活力下降有密切的联系。3.提示CRISP2基因及蛋白可能会成为潜在的诊断标记物,这一基因的进一步功能研究可能会帮助我们阐述弱精子症的相关发病机制。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-22
第一部分基于生物信息学弱精子症相关基因研究  22-35
  1. 材料  23-24
  2. 方法  24-25
  3. 结果  25-30
  4. 讨论  30-33
  5. 第一部分小节  33-35
第二部分弱精子症患者精子中CRISP2基因及其蛋白产物的初步研究  35-55
  1. 材料  36-38
  2. 方法  38-47
  3 结果  47-51
  4. 讨论  51-54
  5. 第二部分小节  54-55
全文总结  55-57
参考文献  57-63
缩略词汇表  63-64
攻读硕士学位期间研究成果  64-65
致谢  65-68
统计学证明  68

弱精子症患者精子中CRISP2基因及其蛋白产物的初步研究

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