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RNAi技术培育抗ToMV加工番茄研究

作　者: 苏建辉
导　师: 向本春；郑银英
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 加工番茄 RNAi 遗传转化子叶 ToMV 抗性
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究是利用RNAi技术培育加工番茄抗病毒新材料。(1)通过农杆菌介导法将抗ToMVRNAi载体转化烟草和加工番茄,在实验过程中优化加工番茄的转化条件,提高加工番茄的转化效率,为培育新的抗病毒种子资源构建平台。(2)对得到的转基因烟草和加工番茄植株通过攻毒试验验证对ToMV有抗性,从而得到抗病毒的转基因加工番茄植株。试验中首先以子叶为外植体,在MS基本培养基中添加不同浓度的卡那霉素(Kan10、30、50mg/L),检测子叶对卡那霉素的抗性,发现子叶外植体的分化被不同程度地抑制。然后诱导培养基卡那霉素的选择选取了梯度变化,0-10d时10mg/L；10-20d时30mg/L；20d以后50mg/L。芽诱导培养基分别添加玉米素(ZT)0.5mg/L和1.0mg/L;6-BA2.0mg/L不同的细胞分裂素,研究分裂素的种类和浓度对芽分化的影响。将侵染后的外植体分别放在23-24℃、26-28℃温度条件下,其他条件相同,研究温度对抗性芽分化的影响。最后对获得的抗卡那霉素抗性植株进行PCR检测,发现ToMV的干扰片段已转入加工番茄品种黑格尔87-5。最后对转基因植株通过攻毒试验RT-PCR检测RNAi效果。通过试验建立加工番茄子叶为外植体的高效遗传转化体系：确定了当预培养时间4d,共培养时间3d,,侵染时间20min,诱导培养基ZT (0.5mg/L), IAA (0.1mg/L),卡那霉素0-10d时10mg/L;10-20d时30mg/L；20d以后50mg/L放在23-24℃分化的温度条件下转化率最高。攻毒试验表明：转基因加工番茄和烟草对ToMV有很好的干扰效果。不同的干扰片段对病毒的基因的降解效果也不同,出现了免疫型和对病毒敏感的不同效果。上述研究发现遗传转化条件的优化,可以提高加工番茄的遗传转化率；基因工程为培育新的抗病毒品种开辟了新途径。试验验证了RNAi技术对培育加工番茄抗病毒新材料的可行性。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
目录  7-9
中英符号缩略词表  9-10
前言  10-11
文献综述  11-21
  1. 加工番茄研究进展  11-12
    1.1 加工番茄产业在世界各地的发展状况  11
    1.2 加工番茄产业发展中存在的问题  11-12
  2 ToMV的生物学特性  12
  3 病毒与寄主之间的互作  12-13
    3.1 番茄的抗性基因  12
    3.2 N基因  12-13
  4 植物基因工程在加工番茄抗病育种中的应用  13-15
    4.1 番茄抗虫基因工程  13
    4.2 番茄抗除草剂工程  13
    4.3 番茄抗病毒工程  13-15
  5 RNAi技术在抗病毒中的应用  15-18
    5.1 RNAi的发现  17
    5.2 RNAi的原理  17-18
    5.3 RNAi的应用  18
  6 外源基因导入植物的方法  18-19
    6.1 原生质体转化途径  19
    6.2 花粉管通道法  19
    6.3 生物弹粒子枪基因转化技术  19
  7 根癌农杆菌介导的遗传转化  19-20
    7.1 农杆菌介导的遗传转化的原理  19-20
    7.2 农杆菌介导的遗传转化的优点  20
  9 本实验的特点及意义  20-21
第二章转基因烟草和加工番茄的遗传转化研究  21-35
  1. 实验材料  21-22
    1.1 菌株  21
    1.2 植物材料  21
    1.3 主要试剂  21
    1.4 培养基  21-22
  2 实验方法  22-35
    2.1 农杆菌感受态的制备(CaCl2法)  22-23
    2.2 重组质粒转化农杆菌GV3101(冻融法)  23
    2.3 植物基因组DNA的提取  23
    2.4 RNAi载体的检测引物  23-24
    2.5 PCR反应条件  24-25
    2.6 加工番茄遗传转化  25-32
    2.7 烟草的遗传转化  32-33
    2.8 结论与讨论  33-35
第三章抗ToMV转基因烟草、加工番茄的攻毒效果分析  35-48
  1 实验材料  35
    1.1 植物材料  35
    1.2 PBS:磷酸缓冲液  35
  2 实验方法  35-37
    2.1 RNA的提取方法  35-36
    2.2 ToMVcDNA第一链的合成  36
    2.3 ToMV检测引物的设计  36-37
    2.4 PCR反应条件  37
  3 转基因烟草攻毒试验过程  37-39
    3.1 活化毒源  37
    3.2 接毒  37
    3.3 RT-PCR检测转基因烟草对病毒的抗性  37
    3.4 结果  37-39
  4 转基因加工番茄攻毒试验  39-45
    4.1 活化毒源  39
    4.2 接毒  39-40
    4.3 RT-PCR检测ToMV  40
    4.4 结果  40-45
  5 结论  45
  6 讨论  45-48
    6.1 RNA介导的病毒抗性与转基因植株中外源基因的整合方式的关系  46
    6.2 基因片段长度对RNA介导抗病性的影响  46-47
    6.3 hpRNA片段结构对RNA介导抗病性的影响  47-48
参考文献  48-52
作者简介  52-53
致谢  53-54
导师评阅表  54

RNAi技术培育抗ToMV加工番茄研究

内容摘要

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