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日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵抗性机理的研究

作　者: 韩瑞娟
导　师: 董立尧
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 高效氟吡甲禾灵 日本看麦娘 抗性 ACCase
分类号: S451.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


日本看麦娘（Alopecurus japonicus）是我国油菜田及小麦田的恶性禾本科杂草,本研究室已发现其对高效氟吡甲禾灵（haloxyfop-R-methyl）产生抗药性,但其抗性机理未见报道。本文在本实验室前期研究的基础上,选用抗性及敏感日本看麦娘为试材,克隆其乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl coenzyme A carboxylase,简称ACCase）的基因序列,找出突变位点,明确靶标酶抗性机理；测定了细胞色素P450(cytochrome P-450 monooxygenases, P450)还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferases, GST）的活性,比较其差异,初步分析这两个代谢酶在抗性产生中的作用；测定抗性及敏感日本看麦娘试材中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢（H202）、丙二醛（MDA）、叶绿素含量,明确氧化酶系等相关指标在抗性和敏感材料中的表现差异。最终根据以上结果综合分析,初步明确日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵产生抗药性的机理。为了明确抗药性发生的分子机理,本实验从分子水平上研究了日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗性机制,初步确定其靶标酶乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的突变位点。通过对抗性及敏感日本看麦娘ACCase基因片段的扩增和克隆,比较两种生物型的基因序列。发现在CT（carboxyltransferase）区有五个突变位点,分别位于1686位丙氨酸突变为苏氨酸（Ala-1686-Thr）；1734位精氨酸突变为甘氨酸（Arg-1734-Gly）；1738位甲硫氨酸突变为亮氨酸（Met-1738-Leu）；1826位异亮氨酸突变为天冬酰胺（Ile-1826-Asn）；2041位异亮氨酸突变为天冬酰胺（11e-2041-Asn）。其中第2041位异亮氨酸突变为天冬酰胺已经在鼠尾看麦娘和黑麦草中报道是与抗性有关的突变位点,因此,此突变也很可能是导致日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵产生抗药性的机理之一。其他四个位点突变是否与抗性相关,尚有待于进一步研究。为了明确日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的代谢抗性机理,本文初步测定了抗性和敏感生物型体内细胞色素P450还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性。未用药剂处理时抗性日本看麦娘的P450与GST活性均高于敏感日本看麦娘。高效氟吡甲禾灵茎叶喷雾处理日本看麦娘后,P450还原酶的活性在抗性和敏感个体内均表现出先升高后降低的趋势；GST活性在抗性生物型中先降低后升高,而在敏感生物型中为降低-升高-降低-升高。敏感植株反应剧烈,P450与GST活性均呈现急剧的变化趋势,而抗性种群的变化趋势平缓。敏感种群较抗性种群先出现下降趋势,其活性也明显低于抗性种群。处理后第10天活性均降到最低,并且依然低于施药初期。根据实验结果初步推测,高效氟吡甲禾灵可能被抗性日本看麦娘体内的细胞色素P450催化,迅速解毒,并在GST的催化下形成了无毒或低毒的化合物,使其免受伤害。这就表明代谢酶活性增强可能是日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵产生抗性的机理之一。采用植物生理生化测定技术,研究了高效氟吡甲禾灵对抗性和敏感日本看麦娘超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）、叶绿素含量的影响,比较两者间的差异。结果表明：用高效氟吡甲禾灵处理后, SOD、CAT、POD活性和H202、MDA、叶绿素含量在抗性及敏感日本看麦娘体内表现的差异极为显著,抗性种群无明显变化,且随着药剂胁迫时间的延长抗性种群变化趋势缓慢于敏感日本看麦娘。至第14天时,敏感种群各类生化指标变化均达到极端值。因此,氧化胁迫产生的抗性可能是日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵抗性的机理之一。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12主要缩略词  12-13前言  13-15  参考文献  14-15第一章 文献综述  15-37  第一节 乙酰辅酶A羧化酶研究进展  15-21    1 乙酰辅酶A羧化酶的生化性质  15-19      1.1 乙酰辅酶A羧化酶的结构  15-17        1.1.1 异质型ACCase  16        1.1.2 同质型ACCase  16-17      1.2 乙酰辅酶A羧化酶的功能  17-18        1.2.1 在光诱导下ACCase调节脂肪酸的合成  17        1.2.2 ACCase控制植物叶片的碳流量(carbon flux)  17        1.2.3 ACCase是脂肪酸合成反馈调节的作用位点  17-18      1.3 乙酰辅酶A羧化酶的表达与调控  18-19    2 乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆  19-20    3 ACCase的基因工程  20-21      3.1 抗除草剂基因工程  20      3.2 提高植物种子含油量基因工程  20-21      3.3 提高藻类油脂含量基因工程  21  第二节 ACCase抑制剂类除草剂的研究进展  21-23    1 ACCase抑制剂类除草剂的抗性情况  21-23      1.1 芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂  21-22      1.2 环己烯酮类除草剂  22-23    2 抗ACCase抑制剂类除草剂杂草的分布现状  23  第三节 杂草抗ACCase抑制剂类除草剂的机制  23-27    1 靶标酶的改变  24    2 膜的效应  24-25    3 代谢作用的增强  25-26    4 ACCase过量表达  26    5 乙烯的释放量减少  26-27    6 除草作用的屏蔽  27  第四节 高效氟吡甲禾灵的研究进展  27-29    1 高效氟吡甲禾灵的理化性质  27    2 高效氟吡甲禾灵的毒性  27    3 高效氟吡甲禾灵适宜的防除对象  27-28    4 高效氟吡甲禾灵的特点  28    5 使用方法  28-29      5.1 油菜田  28      5.2 大豆田  28      5.3 棉花、花生等作物田  28-29  第五节 本研究目的与意义  29  参考文献  29-37第二章 日本看麦娘(Alopecurus japonicus)对高效氟吡甲禾灵靶标酶抗性机理的初步研究  37-51  摘要  37-38  1 材料与方法  38-42    1.1 供试材料  38    1.2 抗性及敏感个体的筛选  38-39      1.2.1 种子生测法筛选抗性及敏感植株  38-39      1.2.2 整株测定法验证筛选的个体  39    1.3 DNA操作  39-40      1.3.1 基因组总DNA的提取  39-40      1.3.2 DNA的PCR扩增  40    1.4 PCR产物的克隆和测序  40-42      1.4.1 连接  40      1.4.2 转化  40      1.4.3 筛选  40-42    1.5 序列分析  42  2 结果与分析  42-47    2.1 抗性及敏感个体的筛选  42    2.2 日本看麦娘基因组DNA检测结果  42-43    2.3 PCR扩增  43-45      2.3.1 CT区PCR扩增  43-45      2.3.2 其他区域PCR扩增  45    2.4 序列比对  45-47      2.4.1 CT区基因序列比对  45-47      2.4.2 其他区域基因序列比对  47  3 讨论  47-48  参考文献  48-51第三章 日本看麦娘(Alopecurus japonicus)对高效氟吡甲禾灵代谢抗性机理的初步研究  51-61  摘要  51-52  1 材料与方法  52-55    1.1 供试材料及药剂  52-53      1.1.1 供试材料  52-53      1.1.2 供试药剂  53    1.2 试验方法  53-55      1.2.1 细胞色素P_(450)还原酶的活性测定  53-54        1.2.1.1 供试材料的准备  53        1.2.1.2 细胞色素P_(450)微粒体的提取  53-54        1.2.1.3 细胞色素P_(450)还原酶的活性测定  54      1.2.2 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性测定  54-55        1.2.2.1 供试材料的准备  54        1.2.2.2 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)的提取  54        1.2.2.3 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)的活性测定  54-55      1.2.3 蛋白含量测定  55    1.3 数据处理  55  2 结果与分析  55-57    2.1 细胞色素P_(450)还原酶的活性  55-56    2.2 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性  56-57  3 讨论  57-58  参考文献  58-61第四章 日本看麦娘(Alopecurus japonicus)对高效氟吡甲禾灵氧化胁迫抗性机理的初步研究  61-73  摘要  61-62  1 材料与方法  62-64    1.1 供试材料  62      1.1.1 供试植物及培养  62      1.1.2 主要化学试剂  62      1.1.3 试验主要仪器  62    1.2 测定方法  62-64      1.2.1 SOD活性测定  62-63      1.2.2 CAT活性测定  63      1.2.3 POD活性测定  63      1.2.4 H_2O_2含量测定  63      1.2.5 MDA含量测定  63-64      1.2.6 叶绿素含量测定  64      1.2.7 蛋白质含量测定  64  2 结果与分析  64-68    2.1 SOD活性  64-65    2.2 CAT活性  65    2.3 POD活性  65-66    2.4 H_2O_2含量  66-67    2.5 MDA含量  67    2.6 叶绿素含量  67-68  3 讨论  68-69  参考文献  69-73全文讨论  73-77全文结论  77-79附录  79-103致谢  103

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 有害植物及其清除 > 杂草 > 化学除草
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