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石河子地区加工番茄病毒种类的ELISA检测及分子鉴定

作　者: 许文博
导　师: 黄家风
学　校: 石河子大学
专　业: 植物病理学
关键词: 加工番茄 ELISA 检测 ToMV BBWV TYLCCNV 分子鉴定
分类号: S436.412
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 41次
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内容摘要

用针对ToMV、BBWV和CMV的单克隆抗体对田间表现坏死条斑症状的315个加工番茄自然病株进行了ELISA 检测,结果表明,ToMV、CMV和BBWV是危害新疆加工番茄的主要病毒,其复合侵染是造成田间坏死条斑症状的主要因素。利用Eviews3.0软件分析血清学数据,发现加工番茄上的ToMV、CMV和BBWV三种病毒的积累量相互影响,并且互为正相关关系,以量化的形式说明了不同病毒相互协生,是造成田间加工番茄坏死条斑病严重危害的主要原因。同时对田间自然发病的21个品种通过血清学检测进行了抗病性鉴定,虽然供试品种均不抗病,但品种之间却表现出一定的抗病性差异。用双生病毒的兼并引物PA/PB分别对石河子地区表现黄色花叶及卷叶症状的16个加工番茄病株XJ26-1至XJ26-16进行了PCR检测,其中12个病株扩增到约500 bp的特异性片段。选取其中代表病株XJ26-4的PCR产物进行克隆、测序,结果表明,该片段为519个核苷酸(nts),为菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒基因组DNA-A的片段,与中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10,AJ319675)同源性为98.8%。由此表明,经PCR检测,具有500bp片段的12个田间病株均有中国番茄黄化曲叶病毒侵染。根据已测序列,设计引物PYF和PYR对XJ26-4 DNA-A进行其余序列(2.3kb)的克隆、测序,将测序结果与519 nts片段拼接后得到XJ26-4 DNA-A全长为2735 nts,具有典型的双生病毒的基因组结构特征,与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)有很高的序列相似性,为91.2～99.5﹪。根据双生病毒分类原则,XJ26-4为中国番茄黄化曲叶病毒XJ26-4分离物,英文名为Tomato yellow leaf curl China virus-XJ26-4,简称为TYLCCNV-XJ26-4。从发生坏死条斑的加工番茄中选择与BBWV2单克隆抗体呈阳性反应的23个病株,以dsRNA为模板,用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物Fab5_R1F和Fab5_R1R进行PCR或RT-PCR,其中19个病株扩增到长约400 bp的预期大小的片段,选取其中代表病株XJ7-5、XJ7-6、XJ7-9和XJ14-1的PCR产物进行克隆、测序,得到XJ7-5、XJ7-6和XJ7-9的基因组片段分别为391 nts、390 nts和392 nts, XJ14-1的两个阳性克隆(XJ14-1a和XJ14-1b)的大小分别为390 nts和354 nts,5个序列之间的同源性为90.7%～98.2%。基因库检索表明,它们均为蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV-2)基因组RNA1的片段,说明经PCR检测,具有400bp片段的19个田间病株均有BBWV2侵染。将已测序列与基因库中已登陆的BBWV2的RNA1核苷酸序列进行比对,在RNA1的序列保守区设计4对引物,对分离物XJ14-1基因组RNA1进行进一步测序,得到XJ14-1 RNA1 3659 nts和1765 nts两段核苷酸序列,序列比较表明,XJ14-1RNA1与韩国的分离物(BBWV-[Korea],AF144234)具有最高的序列同源性。将基因库中已登陆的BBWV2的RNA2核苷酸序列进行序列比对,然后根据RNA2的序列保守区设计引物R2F-1F和R2F-1R。以病株的总RNA为模板,对分离物XJ14-1进行RNA2组分的克隆、测序,获得1300 nts的RNA2序列,与韩国的分离物(BBWV-[Korea],AF104335)具有最高的序列同源性,为93.9%。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-9
主要符号表  9-10
前言  10-11
第一章论文综述  11-23
  1.1 番茄主要病毒病发生概况  11-12
    1.1.1 番茄病毒病田间症状及危害  11
    1.1.2 番茄病毒病的分布及种类  11-12
    1.1.3 新疆加工番茄番茄病毒病研究现状  12
  1.2 烟草花叶病毒属（Tobamovirus）及烟草花叶病毒的研究  12-14
  1.3 番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）研究进展  14-15
  1.4 双生病毒研究进展  15-17
  1.5 蚕豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus，BBWV）研究进展  17-19
  1.6 黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）研究进展  19-20
  1.7 单克隆抗体在植物病毒学中的应用  20-22
  1.8 立题依据  22-23
第二章加工番茄坏死条斑病毒原的ELISA 检测  23-28
  1 材料与方法  23-24
    1.1 毒源和品种  23
    1.2 供试抗血清  23
    1.3 抗原制备  23
    1.4 ELISA 操作步骤  23-24
    1.5 品种抗病性鉴定  24
      1.5.1 病情分级标准和抗病性分类标准  24
      1.5.2 品种带毒指数  24
    1.6 复合侵染病毒之间的相互影响  24
  2 结果与分析  24-26
    2.1 ToMV、BBWV 和CMV 三种病毒的带毒率检测  24
    2.2 加工番茄品种抗病性鉴定  24-26
    2.3 复合侵染病毒之间的相互影响  26
  3 结论与讨论  26-28
第三章加工番茄病毒种类的分子鉴定  28-47
  1 材料与方法  28-35
    1.1 材料  28-29
      1.1.1 毒原  28
      1.1.2 质粒和菌株  28
      1.1.3 常用生化试剂  28
      1.1.4 常用缓冲液的配制  28-29
      1.1.5 引物设计  29
    1.2 方法  29-35
      1.2.1 大量提取方法  29-30
      1.2.2 植物总RNA 的提取  30
      1.2.3 植物总DNA 提取（CTAB 法）  30
      1.2.4 RT-PCR 技术  30-32
      1.2.5 PCR 产物纯化  32
      1.2.6 DNA 克隆技术  32-34
      1.2.7 核苷酸序列测定与分析  34-35
      1.2.8 用于序列比较的病毒序列  35
  2 双生病毒的分子鉴定结果  35-40
    2.1 双生病毒田间样品的分子检测  35-36
    2.2 病毒分离物XJ26-4 的基因组DNA-A 的克隆和测序  36
    2.3 XJ26-4 病毒基因组DNA-A 结构  36-37
    2.4 病毒基因组DNA-A 与其它双生病毒的比较  37-38
    2.5 与其它双生病毒的分子进化分析  38-39
    2.6 DNA-β?组分的检测  39
    2.7 结论与讨论  39-40
  3 蚕豆萎蔫病毒（BBWV）的分子鉴定  40-47
    3.1 BBWV 田间样品的分子检测  40-43
    3.2 病毒分离物XJ14-1 基因组RNA1 核苷酸序列的进一步测定  43-44
    3.3 病毒分离物XJ14-1 基因组RNA2 核苷酸序列的测定  44-45
    3.4 结论与讨论  45-47
全文小结  47-48
参考文献  48-56
附录A 常用缓冲液及培养基配方  56-59
致谢  59-60
作者简介  60-61
导师评阅表  61

石河子地区加工番茄病毒种类的ELISA检测及分子鉴定

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