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JAK/STAT信号通路在DON和T-2毒素对RAW264.7细胞毒性作用中的机制研究

作　者: 柳芹
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 T-2毒素 JAK/STAT 炎性细胞因子 细胞凋亡 细胞周期
分类号: S856.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


单端孢霉烯毒素是由镰刀菌产生的真菌次级代谢产物,为世界范围内许多国家地区食品和饲料中的主要污染性霉菌毒素。T-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)分别为单端孢A类、B类具有代表性的两种真菌毒素,它们对人和动物存在广泛的毒性效应,能严重损伤机体的免疫系统。动物实验表明,在低剂量下,该类毒素能快速激活免疫相关炎性细胞因子基因水平的早期表达,引起免疫刺激；在高剂量下,能严重损伤淋巴结、脾脏等免疫器官,诱导白细胞凋亡,导致白细胞数量降低,引起免疫抑制。该类毒素能与核糖体结合,一方面抑制蛋白质等生物大分子的合成,另一方面通过引起核糖体应激反应,快速激活MAPK通路,调控相关基因的转录活性及mRNA的稳定性并诱导免疫相关及炎性相关基因的表达。大量研究表明炎性细胞因子在单端孢类霉烯毒素的毒性效应中发挥了关键的作用,炎性细胞因子在单端孢类霉烯毒素诱导下的过度表达能引发IgA肾病、白细胞凋亡并导致机体免疫功能紊乱。JAK/STAT是一条与炎性细胞因子传导密切相关的信号通路,它在单端孢类霉烯毒素所介导的毒性效应中是否起到了调控作用,目前并不清楚。由于巨噬细胞是该类毒素作用最为敏感的靶细胞,因此本研究将以RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为模型,并引入AG490和Stattic等通路特异性抑制剂,初步阐明JAK/STAT路径在DON和T-2毒素对RAW264.7单核巨噬细胞中的毒性作用,探讨该通路在DON和T-2毒素诱导细胞凋亡及细胞增殖过程中潜在的分子机制。本研究采用MTT法检测(?)DON(0.25～16μM)(?)口T-2毒素(5～320 nM)对RAW264.7细胞株分别作用4-24 h后细胞增殖的影响,发现DON和T-2毒素能够抑制RAW264.7细胞增殖,表现出时间及剂量依赖性的毒性效应；在加或不加JAK/STAT信号通路特异性抑制剂AG490(10μM和5μM分别为AG490与DON或T-2毒素共同孵育的浓度)和Stattic(10μM和5 gM分别为Stattic与DON或T-2毒素共同孵育的浓度)的情况下,采用实时荧光定量PCR方法检测DON(1-4μM)或T-2毒素(7-28 nM)作用RAW264.7细胞12h后JAK/STAT信号通路中JAK1～3、STAT1～3、负反馈调节蛋白细胞因子信号抑制因子SOCS及炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA的表达情况。结果显示DON和T-2毒素能够剂量依赖性的激活IL-6、IL-1βTNF-a及JAK1、JAK2、STAT1～STAT3(?)口SOCS基因的表达,但对JAK3的激活效应不明显,AG490和Stattic能够抑制DON和T-2毒素诱导的JAK2和STAT1-3的基因表达；采用Western blot方法定量研究DON(2μM)或T-2毒素(14 nM)作用RAW264.7细胞12h后STAT1、p-STAT1 (Try701)、STAT3和P-STAT3 (Tyr705)蛋白表达的影响,结果显示DON和T-2毒素能够显著诱导p-STAT1和p-STAT3的蛋白表达,使STATl和STAT3磷酸化水平增强,在JAK/STAT通路抑制剂AG490和Stattic的干预下,p-STAT1和P-STAT3的蛋白表达水平呈现不同程度的下降,与荧光定量PCR基因表达结果一致；在AG490和Stattic的干预下,由DON(2μM)和T-2毒素(14 nM)诱导的IL-6、IL-1p和TNF-a基因表达均显著受到了抑制。以上结果说明DON和T-2毒素能够分别在mRNA和蛋白水平激活JAK/STAT通路,该通路在DON和T-2毒素诱导炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-a基因表达的过程中发挥了重要的调控作用。JAK/STAT通路负反馈调节因子SOCS基因表达的升高,表明SOCS可能对DON和T-2毒素诱导IL-6等炎性细胞因子的生成起到了适度负性调节作用,定水平上避免了细胞的过激反应,发挥了重要的生理学意义。在时效关系的研究中,采用荧光定量PCR方法检测DON(2μM)和T-2毒素(14nM)分别作用于细胞0.25～24 h后STAT1和STAT3的基因表达情况。在与MAPK通路交互作用的研究中,引入p38特异性抑制剂SB253080(20μM)和ERK特异性抑制剂PD98059(20μM)预处理RAW264.7细胞45 min,同样的方法检测DON(2μM)和T-2毒素(14 nM)作用RAW264.7细胞12 h后STAT1和STAT3的基因表达。结果显示DON和T-2毒素能在早期(0.5-1 h)激活MAPK(p38),对STAT1和STAT3的(?)mRNA表达水平在8h开始出现显著性升高,激活高峰出现在12 h。在JAK/STAT与MAPK通路的交互作用研究中发现SB253080能显著抑制DON诱导STAT3的mRNA表达,PD98059对DON诱导的STAT1和STAT3表达无明显抑制作用；而在T-2毒素的诱导下,发现SB253080和PD98059均能显著抑制STAT1的表达,T-2毒素诱导的STAT3的基因表达在SB253080的干预下无明显变化,但能受到PD98059的显著抑制。由此可以看出DON诱导的STAT1的激活非依赖于p38和ERK,对STAT3的激活依赖于p38却非依赖于ERK。而T-2毒素诱导的STAT1的表达均依赖于p38和ERK的调控,其引起的STAT3的激活则依赖于ERK,非依赖于p38。我们推测JAK/STAT信号通路可能是继DON和T-2毒素快速激活MAPK路径之后的一个下游分子靶点。采用流式细胞术(FCM)检测DON(1-4μM)和T-2毒素(7-28 nM)对RAW264.7细胞线粒体膜电位的变化,及其对细胞凋亡及细胞周期的影响；通过荧光定量PCR的方法检测JAK/STAT通路下游调控细胞凋亡及细胞周期相关基因Bax、Bcl-2、Bcl-xl、Cyclin D1和p21的mRNA表达情况。DON和T-2毒素能显著降低线粒体膜电位并诱导细胞凋亡。荧光定量结果显示,AG490和Stattic的干预后,调控细胞凋亡的两对异源二聚体Bcl-xl/Bax和Bcl-2/Bax的基因表达相对比值显著降低。表明在DON和T-2毒素的诱导下,JAK/STAT通路可能通过调控其下游靶基因Bax、Bcl-xl和Bcl-2的相对基因表达量,来介导毒素对RAW264.7细胞的致凋亡效应。其中STAT1的促凋亡作用可能在DON和T-2毒素诱导细胞凋亡过程中发挥了主导作用。DNA倍体分析发现,DON能使RAW264.7细胞明显阻滞在G2/M期,T-2毒素能导致RAW264.7细胞阻滞在G0/G1期。STAT1和STAT3下游调控细胞周期进程的两个关键基因p21和Cyclin D1,在DON的作用下均发生剂量依赖性的上调,在T-2毒素的作用下p21呈现上调趋势,而Cyclin D1基因表达明显下调。结果暗示DON和T-2毒素对细胞周期进程不同时相的阻滞效应,可能与毒素通过JAK/STAT通路对p21和Cyclin D1的不同转录活性有关。综上,本研究首次发现了JAK/STAT信号通路能在DON和T-2毒素的诱导下被激活,并证实该通路能够调控DON和T-2毒素所诱导的炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达。DON和T-2毒素对JAK/STAT与MAPK通路的激活具有一定的时空整合规律,JAK/STAT可能是继DON和T-2毒素快速激活MAPK路径之后的一个下游分子作用靶点。该通路在DON和T-2毒素诱导的细胞凋亡及细胞周期阻滞的过程中均发挥了重要的调控作用。

全文目录


摘要  8-11
Abstract  11-15
缩略语表  15-17
1. 前言  17-22
  1.1 研究背景  17-19
  1.2 JAK/STAT信号通路研究进展  19-20
  1.3 本课题研究思路  20-21
  1.4 研究内容和目标  21-22
2. 材料和方法  22-40
  2.1 细胞株  22
  2.2 药品和试剂  22-24
  2.3 主要仪器和设备  24-25
  2.4 溶液配制  25-27
  2.5 细胞的复苏、传代和冻存  27-28
  2.6 MTT法检测DON和T-2毒素对RAW264.7细胞的活力影响  28
  2.7 实时荧光定量PCR检测通路相关基因mRNA的表达  28-33
    2.7.1 细胞处理及分组  28-29
    2.7.2 总RNA的提取  29-30
    2.7.3 总RNA纯度及完整性的检测  30
    2.7.4 逆转录反应  30
    2.7.5 实时荧光定量PCR检测目的基因mRNA表达水平  30-33
  2.8 Western blot方法测定STAT1和STAT3的磷酸化水平  33-37
    2.8.1 细胞处理及分组  33
    2.8.2 细胞蛋白提取  33-34
    2.8.3 蛋白浓度测定  34
    2.8.4 SDS-PAGE电泳  34-35
    2.8.5 Westerm印迹杂交  35-37
  2.9 Annexin-Ⅴ FITC/PI双染法检测细胞凋亡  37-38
  2.10 细胞线粒体膜电位的检测  38
  2.11 细胞周期的检测  38-39
  2.12 统计学分析  39-40
3. 结果与分析  40-63
  3.1 DON和T-2毒素致RAW264.7细胞剂量及时间依赖性毒性作用  40-41
  3.2 细胞RNA质量的鉴定  41
  3.3 DON和T-2毒素对RAW264.7细胞炎性细胞因子mRNA水平的影响  41-42
  3.4 DON和T-2毒素对负反馈调节蛋白SOCS mRNA水平的影响  42-43
  3.5 DON和T-2毒素对JAK/STAT信号通路关键分子mRNA水平的影响  43-45
  3.6 在通路抑制剂的干预下DON和T-2毒素对JAK/STAT信号通路中关键分子mRNA水平的影响  45-47
  3.7 DON和T-2毒素对转录因子STAT1和STAT3蛋白表达的研究  47-49
  3.8 JAK/STAT通路对DON和T-2毒素诱导炎性细胞因子表达的研究  49-50
  3.9 DON和T-2毒素诱导STAT1和STAT3基因表达时效关系的研究  50-53
  3.10 MAPK与JAK/STAT通路交互作用的研究  53-54
  3.11 DON和T-2毒素对细胞凋亡的影响  54-56
  3.12 DON和T-2毒素对细胞膜电位的影响  56-57
  3.13 JAK/STAT通路对DON和T-2毒素诱导细胞凋亡的机理研究  57-59
  3.14 DON和T-2毒素对细胞周期的影响  59-62
  3.15 DON和T-2毒素对细胞周期相关基因p21和CyclinD1表达的影响  62-63
4. 讨论  63-76
  4.1 在单端孢毒素诱导下的炎性细胞因子调控方式  63-66
  4.2 JAK/STAT信号通路激活的毒理学意义及其与MAPK潜在的交互作用  66-68
  4.3 JAK/STAT信号通路对细胞凋亡的影响  68-70
  4.4 JAK/STAT信号通路对细胞周期阻滞效应的影响  70-72
  4.5 SOCS对单端孢类毒素潜在的毒理学意义  72-76
5. 全文总结  76-77
文献综述  77-94
参考文献  94-109
致谢  109-110
附录  110-116

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医内科学 > 其他
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