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牦牛能量物质转运及代谢的部分相关基因的克隆测序、表达谱及多态性研究

作　者: 王国生
导　师: 郑玉才；林亚秋
学　校: 西南民族大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 牦牛低氧 GLUT4 MCT1 MCT4 乳酸脱氢酶定量PCR PCR-RFLP
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究的主要目的是分析牦牛(Bos grunniens)在高原缺氧环境下,其肌肉组织中与能量物质转运和代谢相关的几个基因的序列和表达特点。研究的基因包括:葡萄糖转运蛋白4(glucose transporters 4 , GLUT4)、单羧酸转运蛋白1 (monocarboxylatetransporter1,MCT1)、单羧酸转运蛋白4 (MCT4)、乳酸盐脱氢酶-1(lactate dehydrogenase-1,LDH-1)。实验以九龙牦牛为研究对象,利用RT-PCR方法克隆GLUT4、MCT1、MCT4基因的cDNA序列;采用实时荧光定量PCR技术检测GLUT4、MCT1、MCT4基因在不同年龄九龙牦牛背最长肌和股四头肌中的表达,并与黄牛进行比较;利用RT-PCR方法克隆LDH-1基因3个遗传变异体的cDNA序列,并建立基于基因组DNA的突变位点的PCR-RFLP检测方法。主要研究结果如下:1.九龙牦牛GLUT4、MCT1、MCT4基因CDS区序列及编码氨基酸序列长度分别为:1530bp/509AA、1506bp/501AA和1386bp/460AA。与普通牛相比,核苷酸及推导的氨基酸序列相似性均在99%以上。2.肌肉组织中GLUT4、MCT1、MCT4基因表达分析显示:MCT1基因表达在黄牛背最长肌与股四头肌中差异显著(P<0.05);MCT1基因表达在九龙牦牛与黄牛背最长肌中差异极显著(P<0.01)。3.九龙牦牛LDH-1基因遗传变异体(LDHB-F、LDHB-M、LDHB-S)CDS区序列全长1005bp,编码334个氨基酸。两个有义突变为:LDHB-S第689位的A/C突变、LDHB-F第896位的G/A突变;造成2个氨基酸的差异:LDHB-S第230位E/A突变、LDHB-F第299位R/Q突变。4.建立了LDHB-F中第896位的G/A突变的PCR-RFLP检测方法。等位基因A和G频率分别为0.26、0.74;三种基因型AA、AG和GG频率分别为0.04、0.43、0.53。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
前言  9-10
第一部分文献综述  10-15
  1 葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的结构及分布  10-11
  2 单羧酸转运蛋白1、4(MCT1、4)的结构及分布  11-12
  3 能量代谢中GLUT4、MCT1、MCT4 的相关研究  12-15
    3.1 MCT1、MCT4 功能研究  12-13
    3.2 缺氧条件下GLUT4、MCT1、MCT4 基因表达研究  13
    3.3 运动状态下GLUT4、MCT1、MCT4 基因表达研究  13-14
    3.4 GLUT4、MCT1、MCT4 基因表达发育性变化研究  14-15
第二部分实验研究  15-55
  第一章九龙牦牛 GLUT4、MCT1、MCT4 基因的克隆及序列分析  15-32
    1 实验材料  15-16
      1.1 实验动物  15
      1.2 实验试剂  15
      1.3 主要仪器  15-16
      1.4 生物学应用软件  16
    2 实验方法  16-18
      2.1 总RNA 的提取  16
      2.2 反转录cDNA  16-17
      2.3 PCR 扩增GLUT4、MCT1、MCT4 基因  17
      2.4 PCR 产物胶回收  17
      2.5 胶回收产物的T 载体连接  17-18
      2.6 转化  18
      2.7 挑菌  18
      2.8 测序  18
    3 实验结果  18-30
      3.1 总RNA 的提取结果  18-19
      3.2 GLUT4、MCT1、MCT4 基因RT-PCR 扩增结果  19-20
      3.3 GLUT4、MCT1、MCT4 基因与载体的重组及重组子的鉴定  20
      3.4 GLUT4、MCT1、MCT4 重组质粒测序  20
      3.5 九龙牦牛 GLUT4 基因核苷酸序列及氨基酸序列与普通牛比对  20-24
      3.6 九龙牦牛MCT1 基因核苷酸序列及氨基酸序列与普通牛比对  24-27
      3.7 九龙牦牛MCT4 基因核苷酸序列及氨基酸序列与普通牛比对  27-30
    4 讨论  30-32
  第二章九龙牦牛 GLUT4、MCT1、MCT4 基因mRNA 水平的表达研究  32-42
    1 实验材料  32-33
      1.1 实验动物  32
      1.2 主要试剂  32
      1.3 主要仪器  32-33
    2 实验方法  33-35
      2.1 RNA 提取和反转录  33
      2.2 荧光定量引物设计  33
      2.3 荧光定量PCR 的反应体系  33-34
      2.4 荧光定量PCR 扩增程序的设定  34
      2.5 标准曲线的建立  34
      2.6 相对定量计算方法的确定  34-35
    3 实验结果  35-40
      3.1 GLUT4、MCT1、MCT4、GAPDH 基因标准曲线的建立  35-37
      3.2 牦牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4 基因的发育谱  37-38
      3.3 牦牛与黄牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4 基因表达比较  38-39
      3.4 背最长肌与股四头肌GLUT4、MCT1、MCT4基因mRNA水平比较  39-40
    4 讨论  40-42
      4.1 GLUT4、MCT1、MCT4 基因表达的发育谱  40
      4.2 GLUT4、MCT1、MCT4 基因表达的牛种间比较  40-41
      4.3 背最长肌、股四头肌GLUT4、MCT1、MCT4 基因表达比较  41-42
  第三章九龙牦牛 LDH-1 基因遗传变异体的克隆测序分析  42-47
    1 实验材料  42
    2 实验方法  42-43
      2.1 PCR 扩增LDH-1 基因  42-43
    3 实验结果  43-46
      3.1 LDH-1 的 RT-PCR 扩增结果  43
      3.2 LDH-1 目标片段与载体的重组及重组子的鉴定  43-44
      3.3 LDH-1 基因重组质粒测序  44
      3.4 九龙牦牛 LDH-1 基因遗传变异体核苷酸序列的比对  44-45
      3.5 九龙牦牛LDH-1 基因遗传变异体氨基酸序列的比对  45-46
      3.6 九龙牦牛LDH-1 基因遗传变异体分子量及等电点预测  46
    4 讨论  46-47
  第四章九龙牦牛LDH-1基因遗传变异体的多态性研究及与同工酶谱的关联  47-55
    1 实验材料  47-48
      1.1 实验动物  47
      1.2 实验试剂  47
      1.3 主要仪器  47-48
    2 实验方法  48-50
      2.1 基因组DNA 的提取  48
      2.2 LDHB-F 的PCR 扩增  48
      2.3 LDHB-F 酶切  48
      2.4 基因型频率和等位基因频率计算  48-49
      2.5 遗传平衡吻合度检验  49
      2.6 同工酶样品处理  49
      2.7 同工酶电泳相关试剂配制  49-50
      2.8 同工酶电泳实验步骤  50
    3 实验结果  50-53
      3.1 牦牛肌肉组织DNA 提取结果  50
      3.2 LDHB-F 的PCR 扩增结果  50-51
      3.3 LDHB-F 基因的酶切检测结果  51
      3.4 LDHB-F 基因的等位基因频率及基因型频率分析  51-52
      3.5 LDHB-F 基因多态位点的Hardy-Weinberg 平衡检测  52
      3.6 LDH 同工酶电泳结果  52-53
      3.7 LDHB-F 基因多态性与LDH 同工酶电泳结果关联  53
    4 讨论  53-55
结论  55-56
参考文献  56-59
致谢  59-61
附录1:基因克隆相关试剂的配制方法  61-62
附录2: MCT1、 MCT4、GAPDH 基因扩增曲线及标准曲线  62-63

牦牛能量物质转运及代谢的部分相关基因的克隆测序、表达谱及多态性研究

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