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猪繁殖与呼吸综合征抗体免疫胶体金快速诊断试纸的研制
作 者: 陈一鸣
导 师: 熊焰
学 校: 四川农业大学
专 业: 微生物学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合症 抗体 胶体金 诊断试纸
分类号: S858.28
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸系统传染病。猪是此病的唯一天然宿主。该病以接触性、高度传染性、高发病率,慢性和高死亡率为特征。病猪生长十分缓慢,甚至停滞生长,严重影响养猪业的经济效益,因此对该病及时作出诊断有利于降低经济损失。本研究针对目前PRRS诊断耗时长的问题,运用胶体金免疫层析技术建立PRRS抗体快速诊断方法。本研究以PRRSV POP3毒株为试验材料,结合使用中性盐沉淀法和凝胶层析法获得其结构蛋白,经SDS-PAGE电泳检测显示含六条蛋白条带,分子量分别为:68.1KD、55.2KD、38.9KD、37.6KD、35.1KD、33.9KD,其中55.2KD.38.9KD.37.6KD、35.1KD、33.9KD为PRRSV蛋白。用纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白制备铝胶疫苗免疫2kg左右成年健康家兔,获得的兔抗PRRSV高免血清与纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白经双向琼扩试验,检测到抗血清效价为1:16。采用辛酸-硫酸铵盐析分离纯化血清IgG,经SDS-PAGE检测显示分子量为56.5KD和26.6KD的蛋白条带。以柠檬酸三钠为还原剂制备胶体金,用紫外分光光度计(400nm-700nm)扫描分析显示,制备的胶体金颗粒大小均一,约为19.76nm,适合免疫标记。以制备好的胶体金标记纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白,获得稳定的免疫胶体金。确定最佳标记条件为:pH=7.8,病毒蛋白的标记结合量为4.8μg/ml。用标记好的免疫胶体金浸泡聚酯纤维素膜,干燥后制得金标垫。同时将纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白和兔抗PRRSV IgG分别作为诊断试纸的检测线(T线)和控制线(C线)包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上,组装成试纸条。确定了免疫胶体金的稀释度为1:1,T线包被浓度为1 mg/ml,C线包被浓度为2mg/ml。用研制的PRRS抗体试纸条与ELISA检测方法分别对36份血清样品进行检测。结果显示ELISA法检测阳性率为75%,PRRS抗体诊断试纸检测阳性率为61.1%。用PRRS抗体试纸条检测与ELISA检测方法进行比较,结果显示PRRS抗体试纸条的敏感度为81.5%,特异度为100%,符合率为86.1%,重复性良好。试验证明PRRS抗体试纸条具有高效、价廉、敏感性高、特异性强、操作简便便于基层推广的实际运用价值。
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全文目录
中文摘要 3-4 Abstract 4-8 1.前言 8-17 1.1 PRRSV的理化性质 8 1.2 PRRSV的生物学特性 8-9 1.2.1 抗体依赖性增强作用 8-9 1.2.2 毒株变异和毒力差异 9 1.3 PRRSV的流行病学和危害性 9-10 1.4 PRRS的诊断方法概述 10-13 1.4.1 临床及病原学诊断 10-11 1.4.2 血清学诊断 11-12 1.4.3 分子生物学诊断 12-13 1.5 胶体金技术的研究进展 13-17 1.5.1 胶体金技术的原理 13 1.5.2 胶体金的制备 13-14 1.5.3 免疫胶体金的标记 14 1.5.4 免疫胶体金技术在诊断中的应用 14-17 1.6 目的与意义 17 2.试验材料 17-19 2.1 试验毒株及培养材料 17 2.2 实验动物 17-18 2.3 主要仪器设备及器材 18 2.4 SDS-PAGE相关溶液 18-19 3.试验方法 19-25 3.1 病毒培养及病毒蛋白纯化 19-20 3.1.1 病毒的复苏及培养 19 3.1.2 PRRSV毒力试验(96孔盘法) 19 3.1.3 PRRS病毒蛋白纯化 19-20 3.2 PRRSV高免血清的制备 20 3.3 辛酸-硫酸铵盐析分离免疫血清IgG 20-21 3.4 胶体金制备及质量评价 21 3.4.1 还原法制备胶体金 21 3.4.2 胶体金的质量评价 21 3.5 免疫胶体金的制备 21-23 3.5.1 免疫胶体金标记最适pH值的测定 21-22 3.5.2 免疫胶体金标记最佳蛋白浓度的确定 22 3.5.3 免疫胶体金标记 22-23 3.6 试纸条的研制 23-25 3.6.1 免疫胶体金稀释度和抗原抗体包被浓度的确定 23 3.6.2 免疫诊断试纸的组装 23-24 3.6.3 PRRS抗体免疫胶体金快速诊断试纸检测结果判读 24 3.6.4 重复性试验 24 3.6.5 稳定性试验 24 3.6.6 特异性试验 24 3.6.7 符合性试验 24-25 4 试验结果 25-31 4.1 病毒培养 25 4.2 PRRSV毒力试验 25-26 4.3 PRRS病毒蛋白纯化 26 4.4 免疫血清IgG的分离 26-27 4.5 胶体金的制备及质量评价 27-28 4.6 免疫胶体金的制备 28-29 4.6.1 免疫胶体金标记最适pH值的测定 28 4.6.2 胶体金标记最佳病毒蛋白浓度的确定 28-29 4.7 试纸条的研制 29-31 4.7.1 免疫胶体金稀释度及抗原抗体包被浓度的确定 29 4.7.2 试纸条初试 29 4.7.3 重复性试验 29-30 4.7.4 稳定性试验 30 4.7.5 特异性试验 30 4.7.6 符合性试验 30-31 5. 讨论 31-35 5.1 PRRSV毒力试验及病毒蛋白纯化 31-32 5.2 免疫血清制备和IgG的分离 32-33 5.3 胶体金的制备 33-34 5.4 免疫胶体金的制备 34 5.5 试纸条的制作和初步应用 34-35 6. 结论 35-37 参考文献 37-41 致谢 41
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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