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沉默CD55基因对胰腺癌生物学行为的影响

作　者: 何政
导　师: 秦仁义
学　校: 华中科技大学
专　业: 普通外科
关键词: 胰腺癌 CD55 慢病毒载体 RNA干扰 cD55 慢病毒
分类号: R735.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：检测CD55在人胰腺癌组织中的表达,分析其临床意义；检测CD55在胰腺癌细胞系的表达,确定实验对象细胞。材料及方法：用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR),免疫组织化学染色(IHC)及免疫印迹(Western blot)检测CD55在12对人胰腺癌及癌旁组织中的表达,另外31例人胰腺癌组织仅用用IHC检测,分析IHC检测的总共43例人胰腺癌中CD55表达与临床病理因素的关系；Western blot检测CD55在6种人胰腺癌细胞系中的表达。结果:RT-qPCR结果显示在12对胰腺癌、癌旁组织中胰腺癌组织CD55 mRNA的表达水平(中位数：4.77895)明显高于癌旁组织CD55 mRNA的表达水平(中位数：2.45131)(P<0.05)；免疫组化染色显示在12对胰腺癌、癌旁组织中胰腺癌组织CD55阳性表达率和阳性细胞计数(100%呈强阳性)明显超过癌旁组织(16.7%呈弱阳性)(P<0.05)；Western blot检测结果显示在12对胰腺癌、癌旁组织中91.7%胰腺癌组织CD55蛋白表达量(中位数：5.57578)高于癌旁组(中位数：1.8713)(P<0.05)；IHC检测总共43例胰腺癌组织CD55蛋白表达发现38例呈阳性表达,阳性率为88.3%,发现CD55蛋白表达与胰腺癌的分化程度、淋巴转移、临床分期呈正相关(P<0.05),而与患者年龄、性别无明显相关性(P>0.05); Western blot检测结果显示在6种人胰腺癌细胞系中仅PANC-1和BxPC-3通过Western blot检测提示BxPC-3和PANC-1 CD55蛋白表达水平较高(CD55蛋白相对表达量分别为3.159和1.726)表达较高。结论：CD55在人胰腺癌中高表达,CD55蛋白表达与胰腺癌的分化程度、淋巴转移、临床分期呈正相关。BxPC-3可作CD55基因沉默实验研究对象。目的：本部分构建并鉴定靶向抑制人CD55基因shRNA慢病毒载体的学位论文">慢病毒载体并包装成慢病毒,并检测病毒稳转细胞后CD55抑制效应。方法:Pubmed搜寻国外文献人CD55基因RNA干扰试验已证实序列,定向克隆至慢病毒载体pGCSIL-GFP,进行细菌阳性克隆PCR鉴定和质粒测序。构建的阳性重组慢病毒载体命名为CD55-RNAi,并将其包装成慢病毒CD55-RNAi-LV,滴定法测定滴度。将慢病毒转染前述选定的CD55蛋白表达较高的BxPC-3细胞系,通过细胞流式检测转染效率,有限稀释法培养稳定转染细胞株,RT-qPCR和Westem blot验证稳定转染细胞株中shRNA慢病毒对CD55表达的抑制效应。结果：细菌阳性克隆的PCR鉴定结果与预期相符,质粒测序结果显示插入的目的片段序列和合成序列吻合一致,获得阳性重组慢病毒载体CD55-RNAi,将其进行病毒包装得到CD55-RNAi-LV后滴度测定为6.00×108Tu/ml。BxPC-3细胞的转染效率>60%,稳定转染CD55-RNAi-LV和NC-GFP-LV(慢病毒包装作对照的空载体)的BxPC-3细胞株建立,RT-qPCR和Westem blot分别在核酸和蛋白水平证实稳定转染CD55.RNAi.LV细胞株中与未转染病毒的BxPC-3细胞相比CD55基因的抑制率为75.92%,CD55蛋白表达抑制率为88.64%。结论：完成CD55靶向抑制重组载体构建和慢病毒包装,稳定转染CD55-RNAi-LV的BxPC-3细胞株中CD55基因被有效沉默,为后续实验探讨胰腺癌中CD55的功能做了准备。目的：探讨沉默CD55基因对胰腺癌BxPC-3细胞迁移、侵袭和生长的影响。方法：稳定转染CD55-RNAi-LV的BxPC-3细胞株(有限稀释法)为实验组,稳定转染NC-GFP-LV(慢病毒包装作对照的空载体,由上海吉凯赠送)BxPC-3细胞株为对照组,没有进行任何处理的BxPC-3做空白组。Transwell法检测细胞体外迁移、侵袭能力改变,并通过RT-qPCR和Western blot检测细胞转移侵袭相关蛋白的表达。流式术检测细胞凋亡,用BrdU流式细胞术检测三组细胞增殖情况,应用PI单染流式细胞术分析三组细胞周期改变,建立实验组和对照组细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,观察抑制CD55基因对裸鼠成瘤的影响。结果:Transwell实验发现实验组细胞迁移数目均值(79.8±7.62)比对照组细胞(103.5±10.17)、空白组细胞(105.9±9.53)减少(P<0.05),实验组细胞侵袭数目均值(25.41±4.96)比对照组细胞(54.95±6.58)、空白组细胞(57.62±7.63)减少(P<0.05)；与空白组细胞和对照组细胞比较,实验组细胞在mRNA和蛋白表达水平E-cadherin增高,MMP—2mRNA和蛋白表达水平均降低,活性MMP—9蛋白降低(P<0.01),而空白组细胞和对照组细胞间无显著性差异(P>0.05)。用流式细胞术检测三组细胞增殖发现实验组细胞凋亡比率均值(33.84±1.09)%较空白组和对照组分别(3.32±0.19)%和(15.45±0.47)%显著增加(P<0.05)；用BrdU流式细胞术检测三组细胞增殖提示实验组细胞增殖率均值(30.06±0.97)%较空白组和对照组(42.28±2.31)%和(40.41±1.29)%减少(P<0.05)；应用PI单染流式细胞术分析三组细胞周期发现与空白组和对照组相比,实验组细胞G1期升高,G2期变化不明显,S期下降(P<0.05)；裸鼠皮下移植成瘤实验发现对照组和空白组在皮下接种2周左右肉眼即可见瘤体,实验组接种3周出现肉眼可见瘤体,每周测量瘤体体积实验组体积均明显小于对照组和空白组(P<0.05)。结论：沉默CD55基因降低胰腺癌细胞系BxPC-3迁移、侵袭能力,抑制胰腺癌细胞系BxPC-3体内外生长,可望成为胰腺癌新的治疗靶点。

全文目录

中文摘要  5-9
Abstract  9-14
1 第一部分 CD55在人胰腺癌组织中表达及临床意义  14-31
  前言及硏究背景  14-16
  材料和方法  16-23
  结果  23-27
  讨论  27-29
  参考文献  29-31
2 第二部分靶向人CD55基因shRNA慢病毒载体的学位论文">慢病毒载体的构建及鉴定  31-47
  前言  31-32
  材料和方法  32-38
  结果  38-43
  讨论  43-45
  参考文献  45-47
3 第三部分慢病毒介导CD55基因沉默对人胰腺癌BxPC-3 细胞生物学行为的影响  47-64
  前言  47-48
  材料与方法  48-56
  结果  56-60
  讨论  60-62
  参考文献  62-64
4 全文小结  64-65
综述一 CD55在人类恶性肿瘤的表达和癌症诊疗中的作用  65-73
  参考文献  71-73
综述二胰腺癌基因治疗和载体  73-89
  参考文献  86-89
英文缩略词  89-90
攻读博士研究生期间发表文章  90-91
致谢  91-92

沉默CD55基因对胰腺癌生物学行为的影响

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