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粘细菌抗肿瘤活性物质筛选及对荷瘤小鼠抑瘤活性和机制研究

作　者: 贾宏
导　师: 张利平
学　校: 河北大学
专　业: 动物学
关键词: 粘细菌抑瘤率细胞凋亡 Bcl-2 p53
分类号: R73-36
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本论文对河北省微生物多样性研究与应用实验室保藏的100株粘细菌的发酵产物进行了体外细胞毒筛选，100个发酵液样品中对人乳腺癌细胞MCF-7有抑制作用的达到82%，说明粘细菌次级代谢产物对肿瘤细胞具有普遍的细胞毒作用。一个好的抗肿瘤药物不仅需要对肿瘤细胞有强大的杀伤作用，而且需对人正常细胞有很小的损害，通过对正常二倍体人胚肺成纤维细胞存活率的测定，选取2^#、15^#、24^#、37^#、66^#、87^#等6株粘细菌的发酵产物，通过利用人子宫颈癌HeLa细胞和人肺腺癌A549进行复筛，结果显示15^#菌株发酵产物对A549和HeLa抑制作用较强，72h的IC50分别为6.66μg/mL和14.70μg/mL，且其抑制作用具有较好的时效关系，对人正常二倍体MRC细胞毒性较小，其实验重复性好，初筛和复筛结果相互印证，有开发成为抗肿瘤药物的潜能，选择进行下一步组分分析。选择甲醇和乙腈作为流动相分别对15^#菌株发酵代谢产物进行梯度洗脱，通过比较可知乙腈对代谢产物的洗脱能力较强，确定15^#菌株发酵代谢产物的最适分离条件为乙腈：水=49:51（体积比），检测波长为350nm，15^#菌株发酵产物分离得到了5个组分，对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制实验结果表明：15-1组分具有很好的量效对应关系，当终浓度为100μg/mL时，15-1对人乳腺癌细胞的抑制率分别为71.73%，其它组分的抑制效果则不明显，说明15-1组分抑制肿瘤细胞生长的活性是较强的。菌株91018是本实验室已筛选出来的具有抗肿瘤活性的菌株，根据已摸索好的液相分离条件，制备菌株91018发酵产物单组分91018-1，当终浓度为100μg/mL时，对人子宫颈癌细胞和人乳腺癌细胞的抑制率分别为69.19%和22.59%。荷瘤小鼠抑瘤实验显示91018-1单组分1.25mg/kg剂量组对于小鼠肝癌H₂₂肿瘤细胞的抑瘤率最高，达到48.7%，剂量过大或过小都不利于抑瘤效果。阳性对照环磷酰胺的抑瘤率达到81.3%，但小鼠体征不好。第8天阳性对照组小鼠有一只死亡，说明环磷酰胺的毒性较大，严重影响了小鼠的健康，而1.25mg/kg剂量组小鼠活动自如，皮毛光滑，食量较正常，体重有明显增加。说明1.25mg/kg剂量的91018-1组分对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长有一定的抑制作用，并且对小鼠的毒性较少。流式细胞仪检测发现1.25mg/Kg实验组细胞凋亡率比阴性对照组明显提高，PI细胞增殖指数样品1.25mg/Kg实验组与阴性对照组存在显著差异，说明1.25mg/Kg实验组S和G₂/M期的细胞减少，细胞被阻止在G₀/G₁期，从而影响DNA的合成。1.25mg/Kg样品组与阴性对照组的p53蛋白表达量存在显著差异，说明凋亡通过p53正调控产生，阻止了DNA合成。Bcl-2蛋白表达量与阴性对照相比不存在显著差异，凋亡不是通过Bcl-2蛋白诱导产生。综合利用质谱（GCT-MS、ESI）、氢谱（¹H-NMR）、碳谱(¹³C-NMR)、二维谱图（DEPT）等现代波谱技术，对91018-1组分进行结构分析。经解析得知该化合物中文名称为粘噻唑。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章绪论  13-22
  1.1 抗肿瘤药物研究的现状与前景  13
    1.1.1 抗肿瘤药物研究状况  13
    1.1.2 抗肿瘤药物研究重要性  13
  1.2 抗肿瘤药物筛选模型的研究  13-15
  1.3 抗肿瘤药物的类型及作用机制  15-17
  1.4 粘细菌  17-19
    1.4.1 粘细菌的特征  17-18
    1.4.2 粘细菌的活性次级代谢产物  18-19
    1.4.3 粘细菌国内研究现状  19
  1.5 线粒体呼吸链复合体Ⅲ抑制剂—粘噻唑  19-20
    1.5.1 呼吸链复合体Ⅲ的结构  19-20
    1.5.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂重要代表化合物—粘噻唑  20
  1.6 本论文的研究内容及方法  20-22
    1.6.1 本论文研究内容  20-21
    1.6.2 本论文研究方法  21-22
第2章粘细菌菌株次级代谢产物的体外抑瘤作用  22-61
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 菌株  22
    2.1.2 细胞株  22
    2.1.3 培养基  22-23
    2.1.4 试剂  23
    2.1.5 试剂配制  23
    2.1.6 主要仪器  23-24
  2.2 实验方法  24-26
    2.2.1 菌株活化  24
    2.2.2 液体培养  24
    2.2.3 发酵培养  24
    2.2.4 发酵液验纯  24
    2.2.5 样品的配制  24
    2.2.6 细胞复苏与培养  24-25
    2.2.7 体外抑瘤实验  25
    2.2.8 数据处理及统计分析  25-26
  2.3 结果与分析  26-61
    2.3.1 利用人乳腺癌 MCF-7 细胞对代谢产物抑瘤活性的检测  26-40
    2.3.2 利用正常二倍体人胚肺成纤维 MRC 细胞对代谢产物毒性检测  40-57
    2.3.3 人子宫颈癌 HeLa 细胞和人肺腺癌 A549 对菌株发酵代谢产物的复筛  57-61
第3章 15~#菌株代谢产物的提取分离  61-67
  3.1 实验材料  61
    3.1.1 实验菌株  61
    3.1.2 培养基和试剂  61
    3.1.3 主要仪器  61
  3.2 实验方法  61-63
    3.2.1 15~#菌株活性物质提取  61
    3.2.2 15~#菌株发酵产物提取分离条件的探索  61-63
  3.3 结果与分析  63-67
    3.3.1 利用甲醇作为流动相对 15~#菌株发酵活性代谢产物的分离提取  63-64
    3.3.2 利用乙腈作为流动相对 15~#菌株发酵活性代谢产物的分离提取  64-67
第4章 15~#菌株代谢产物单组分的活性测定  67-70
  4.1 实验材料  67
    4.1.1 样品和细胞  67
    4.1.2 培养基和试剂  67
    4.1.3 主要仪器  67
  4.2 实验方法  67-68
    4.2.1 单组分抑制肿瘤细胞生长的活性测定  67-68
  4.3 结果与分析  68-70
第5章菌株代谢单组分 91018-1 的制备和活性测定  70-75
  5.1 实验材料  70-71
    5.1.1 样品和细胞  70
    5.1.2 培养基和试剂  70
    5.1.3 主要仪器  70-71
  5.2 实验方法  71-72
    5.2.1 利用 HPLC 对 91018 菌株发酵活性代谢产物的分离提取  71
    5.2.2 单组分抑制肿瘤细胞生长的活性测定  71-72
  5.3 结果与分析  72-75
    5.3.1 利用 HPLC 对 91018 菌株发酵活性代谢产物的分离提取  72-73
    5.3.2 91018-1 单组分的体外抑瘤活性结果  73-75
第6章 91018-1（粘噻唑）对荷瘤小鼠体内抑瘤活性测定  75-83
  6.1 实验材料  75
    6.1.1 实验动物  75
    6.1.2 瘤株  75
    6.1.3 实验样品  75
  6.2 实验方法  75-77
    6.2.1 体内实验剂量的确定  75
    6.2.2 H_(22)实体瘤模型的建立与荷瘤鼠的制备  75-76
    6.2.3 H_(22)小鼠肿瘤组织细胞增殖指数的检测  76
    6.2.4 细胞凋亡相关基因蛋白 p53 及 Bcl-2 的定量检测  76-77
  6.3 结果与分析  77-83
    6.3.1 急性毒性实验  77
    6.3.2 对荷瘤小鼠的抑瘤实验  77
    6.3.3 对荷瘤小鼠体重及体征的影响  77-80
    6.3.4 抑瘤机理测定结果  80-83
第7章 15~#菌株和 91018 菌株的系统发育分析  83-87
  7.1 实验材料  83
    7.1.1 供试菌株  83
    7.1.2 培养基  83
    7.1.3 主要试剂及配方  83
    7.1.4 主要仪器  83
  7.2 实验方法  83-85
    7.2.1 形态学观察  83-84
    7.2.2 16S rDNA 系统发育分析  84-85
  7.3 实验结果  85-87
    7.3.1 形态学观察  85-86
    7.3.2 16S rDNA 的系统发育分析  86-87
结语  87-88
参考文献  88-92
致谢  92-93
攻读学位期间取得的科研成果  93

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