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透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞增殖、分化的干预作用研究

作　者: 廖乃顺
导　师: 陈文列
学　校: 福建中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 透骨消痛胶囊成骨细胞增殖分化 TNF-α
分类号: R274.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：研究透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞增殖、分化的干预作用,探讨药物对成骨细胞成骨功能的调节作用,以利于深入研究透骨消痛胶囊对骨关节炎软骨下骨骨重建的调节作用。方法：1透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞增殖的干预实验1.1采用MTT法筛选药物干预的最佳条件。1.2实验分组：据筛选的药物干预浓度,分正常对照组、TNF-α组、TNF-α+药物(低、中、高)组。1.3指标检测(1)MTT检测各组细胞的OD值。(2)形态学观察：①倒置显微镜观察,比较正常组、TNF-α组、药物组显微形态变化②PI/Hoechst双染激光扫描共聚焦显微镜观察,比较各组细胞死亡率；③透射电镜观察各组细胞超微结构变化。2透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞分化的干预实验2.1实验分组：分成正常对照组、TNF-α组、TNF-α+药物组。2.2指标检测(1)碱性磷酸酶(AKP)活性与骨钙素(OCN)含量：分别取药物干预后2、4、6、8、10、12、14天细胞上清,生化分析AKP活性、ELISA检测OCN含量。(2)特殊染色观察矿化结节：①茜素红染色,光镜观察各组矿化结节的形成情况；②四环素荧光标记,激光扫描共聚焦显微镜观察,比较各组矿化结节的形成情况。(3)扫描电镜观察矿化结节及原位定量分析Ca元素：①扫描电镜观察矿化结节及钙质分泌,比较各组的矿化结节；②采用能谱分析仪对矿化结节进行Ca元素原位定量分析,比较各组在200倍、相同面积下Ca元素含量；并在5000倍下比较各组单细胞及其周围的Ca元素含量。结果：1.透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞增殖的干预作用1.1药物干预最佳条件的选择：药物1.25mg/ml时细胞的OD值最高;在该剂量下药物干预24h时细胞增值率最大1.2细胞增殖的MTT检测：与TNF-α组比较,各药物组的OD值较大,并以中剂量组(1.25mg/ml)最大,提示了药物可降低TNF-α对成骨细胞增殖的抑制作用。1.3细胞增殖的倒置显微镜观察：TNF-α组细胞胞体变小、收缩,多数细胞变圆、漂浮,细胞大量死亡；各药物组细胞形态明显改善,以中剂量组(1.25mg/ml)细胞状态最好,说明了药物对成骨细胞增殖的保护作用。1.4成骨细胞死亡率的激光共聚焦显微镜观察与分析：TNF-α组细胞死亡率达55.07%,而药物组细胞死亡率明显减少为18.68%,说明了药物对细胞生长的保护作用。1.5成骨细胞超微结构的透射电镜观察：TNF-α组多数细胞核内异染色质聚集,核膜鼓起,内质网扩张、核糖体脱落,线粒体固缩,提示这些细胞已变性、坏死；部分细胞收缩,核染色质高度凝聚,核碎裂,细胞凋亡；而药物组多数细胞的细胞核、细胞质等细胞器明显改善。这些提示了药物对TNF-α诱导成骨细胞损伤的改善作用。2.透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞分化的干预作用2.1成骨细胞分化早期标志(AKP活性)、分化晚期标志(OCN含量)的检测：与TNF-α组比较,药物作用2天后,就可促进AKP活性、OCN含量的升高,6天后其促进作用更明显,提示了药物可促进成骨细胞早、晚期分化,并可降低TNF-α对成骨细胞分化的抑制作用。2.2成骨细胞分化成熟标志(矿化结节)的特殊染色观察：茜素红与四环素染色均发现结果显示,TNF-α组未形成矿化结节,而药物组可形成矿化结节,说明药物可促进成骨细胞分化成熟。2.3矿化结节的扫描电镜观察及其Ca元素的原位定量分析：扫描电镜下,TNF-α组无矿化结节,而药物组可见矿化结节。通过Ca元素原位定量的能谱分析显示,药物组的Ca元素无论在低倍或在高倍(单细胞及其周围)中均较TNF-α组高。这进一步说明药物可促进成骨细胞钙质分泌。结论：1,透骨消痛胶囊能促进成骨细胞增殖；并能明显降低TNF-α对成骨细胞增殖的抑制作用；2.透骨消痛胶囊能促进成骨细胞分化、分化成熟及矿化;并能明显降低TNF-α对成骨细胞分化的抑制作用;3.透骨消痛胶囊能明显减少TNF-α对成骨细胞的损伤作用;4.透骨消痛胶囊可干预成骨功能活动的异常(TNF-α介导),这可能是其调节软骨下骨骨重建的作用机制之一。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-12
材料与方法  12-20
  1. 实验材料  12-14
    1.1 细胞株  12
    1.2 实验药物  12
    1.3 主要实验试剂  12
    1.4 主要实验仪器  12-13
    1.5 主要试剂配制  13-14
      1.5.1 完全培养基  13
      1.5.2 MTT工作液  13
      1.5.3 TNF-α工作液  13-14
      1.5.4 茜素红染液  14
  2. 实验方法与步骤  14-20
    2.1 细胞培养  14
      2.1.1 培养条件  14
      2.1.2 细胞传代  14
    2.2 细胞生长曲线分析  14
    2.3 透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞增殖与诱导损伤的干预实验  14-16
      2.3.1 MTT筛选药物干预条件  14-15
      2.3.2 实验分组  15
      2.3.3 MTT检测成骨细胞增殖率  15
      2.3.4 形态学方法观察成骨细胞增殖与损伤  15-16
        2.3.4.1 倒置显微镜观察成骨细胞显微形态  15
        2.3.4.2 激光扫描共聚焦显微镜观察分析成骨细胞死亡率  15-16
        2.3.4.3 透射电镜观察成骨细胞超微结构  16
    2.4 透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞分化的干预实验  16-19
      2.4.1 实验分组  16-17
      2.4.2 生化分析细胞上清AKP活性  17
      2.4.3 ELISA检测细胞上清OCN含量  17-18
      2.4.4 特殊染色观察矿化结节  18
        2.4.4.1 茜素红染色观察矿化结节  18
        2.4.4.2 四环素荧光标记激光扫描共聚焦显微镜观察矿化结节  18
      2.4.5 扫描电镜观察矿化结节及钙元素原位定量分析  18-19
    2.5 数据统计分析  19
    2.6 实验技术路线图  19-20
结果  20-31
  3.1 细胞生长曲线  20
  3.2 透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞增殖与诱导损伤的干预作用  20-24
    3.2.1 药物干预条件的MTT筛选  20-21
    3.2.2 成骨细胞活性与增殖的变化  21-22
    3.2.3 成骨细胞增殖与损伤的形态学变化  22-24
      3.2.3.1 成骨细胞的显微形态变化  22
      3.2.3.2 成骨细胞的死亡率变化  22-24
      3.2.3.3 成骨细胞的超微结构变化  24
  3.3 透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞分化的干预作用  24-31
    3.3.1 成骨细胞分化早期标志AKP活性的变化  24-25
    3.3.2 成骨细胞分化晚期标志OCN含量的变化  25
    3.3.3 成骨细胞分化成熟标志矿化结节的形成情况  25-27
      3.3.3.1 矿化结节的茜素红染色情况  25
      3.3.3.2 矿化结节的四环素染色情况  25-27
    3.3.4 矿化结节形成的微观结构及其钙元素含量变化  27-31
      3.3.4.1 矿化结节形成的微观结构  27
      3.3.4.2 矿化结节的扫描电镜观察情况  27
      3.3.4.3 矿化结节的钙元素含量变化  27-30
      3.3.4.4 单细胞及其周围的钙元素含量变化  30-31
讨论  31-36
  4.1 成骨细胞对OA的研究意义  31
  4.2 TNF-α对OA的研究意义  31-32
    4.2.1 TNF-α概况  31
    4.2.2 TNF-α参与OA软骨下骨骨重建异常  31-32
  4.3 透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞增殖的干预作用  32-33
    4.3.1 透骨消痛胶囊干预最佳条件的选择  32
    4.3.2 透骨消痛胶囊对成骨细胞活性的影响  32
    4.3.3 透骨消痛胶囊对成骨细胞显微形态的影响  32-33
  4.4 透骨消痛胶囊对TNF-α抑制成骨细胞分化的干预作用  33-34
    4.4.1 透骨消痛胶囊对成骨细胞分化早期的影响  33
    4.4.2 透骨消痛胶囊对成骨细胞分化晚期的影响  33
    4.4.3 透骨消痛胶囊对成骨细胞分化成熟的影响  33-34
    4.4.4 扫描电镜结合元素原位定量分析用于研究矿化结节的特色与优势  34
  4.5 透骨消痛胶囊降低TNF-α对成骨细胞的损伤作用  34-35
  4.6 小结  35-36
结论  36
不足与展望  36-37
参考文献  37-40
附录  40-41
致谢  41-42
文献综述  42-51
  参考文献  48-51
作者简历  51

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