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东北地区蜱传病原多样性调查以及检测方法的建立

作　者: 杨志红
导　师: 李长田
学　校: 吉林农业大学
专　业: 生态学
关键词: 多样性 southern杂交荧光定量PCR
分类号: R181.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

蜱是一种媒介生物,可以携带一些病原进行传播。本实验采用聚合酶链式反应(PCR)通过对2009年以及2010年从黑龙江的绥芬河,密山,东宁,虎林,逊克,黑河等地以及内蒙古草原和辽宁朝阳地区采集的蜱虫携带的多种病原体进行检测,发现立克次体、伯氏疏螺旋体、Q热立克次体和巴通体的存在,通过测序分型,伯氏疏螺旋体基因型为B.g,立克次体为斑点热立克次体和斑点伤寒立克次体。09年的黑龙江共96份样本,全沟硬蜱中检测出伯氏疏螺旋体4例阳性,阳性百分比为4.17%； Q热立克次体18例阳性,阳性百分比的18.75%；立克次体34例阳性,阳性百分比为35.42%,其中斑点热立克次体17例包括西伯利亚立克次体检测到的8例阳性,斑疹伤寒立克次体也检测到17例,全沟硬蜱和森林革蜱都有发现,地区除了东宁外都发现其携带；2010年的黑龙江共全沟硬蜱81只,森林革蜱52只和20只血蜱。PCR检测发现携带3例伯氏疏螺旋体,阳性百分比为1.96%；15例Q热立克次体,阳性百分比为9.8%；23例立克次体,阳性百分比为15.03%,其中斑点热立克次体19例,斑疹伤寒立克次体4例；1例巴通体阳性,百分比为0.65%；内蒙古60份亚东璃眼蜱,经检测,发现5例伯氏疏螺旋体,阳性百分比为8.33%；16例Q热立克次体以及2例西伯利亚立克次体,阳性百分比分别为26.67%和3.33%；辽宁朝阳98个样本,发现了2例伯氏疏螺旋体和9例Q热立克次体,阳性百分比分别为2.04%,9.18%；伯氏疏螺旋体及立克次体类携带比较广泛,10年的蜱种发现了巴通体,虽然只有一例,但是巴通体在我国发现感染的不多,更应该加强贸易往来间的安检,以防从国外传来新的病原物种。Q热立克次体在东北地区首次发现大规模的感染情况,因此要尽可能的排除假阳性的出现,对阳性结果进行southern杂交验证。Southern杂交结果表明蜱虫携带大量Q热立克次体,又一次拉响了警报。建立的荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性,较高的特异性,灵敏度为37拷贝/μL,特异性验证的r值为0.997,因此具备实用性。本实验通过对病原多样性的监测调查以及方法的建立,为我国边境地区公共卫生安全做出贡献,掌握病原的多样性,可以为预防做准备,对于保护人类生命财产安全具备重要的意义。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章前言  9-13
  1.1 东北及内蒙边境地区环境的多样性  9-10
  1.2 蜱以及携带病原体的多样性及研究现状及检测方法  10-12
  1.3 病原体生态多样性调查的意义以及必要性  12-13
第二章 2009年黑龙江,辽宁朝阳以及内蒙古地区蜱传病原体调查检测  13-23
  2.1 试验材料  13-14
    2.1.1 2009年各地区不同种类蜱虫采集情况  13-14
    2.1.2 仪器和试剂  14
  2.2 试验方法  14-19
    2.2.1 DNA,RNA的提取  14-15
    2.2.2 引物的合成  15-17
    2.2.3 各地区样本的检测反应  17-18
    2.2.4 伯氏疏螺旋体以及立克次体PCR产物纯化  18
    2.2.5 连接已经纯化好的PCR产物和载体  18
    2.2.6 感受态细胞的制备以及质粒的重组  18-19
    2.2.7 PCR产物测序  19
  2.3 结果与分析  19-22
    2.3.1 黑龙江2009年采集的蜱虫检测结果  19-21
    2.3.2 内蒙古及辽宁朝阳地区蜱虫样本检测结果  21-22
  2.4 讨论  22-23
第三章 2010年黑龙江蜱虫样本病原体调查检测  23-29
  3.1 试验材料  23-24
    3.1.1 2010年黑龙江各地区蜱虫样本的采集情况  23
    3.1.2 仪器和试剂  23-24
  3.2 试验方法  24-26
    3.2.1 DNA,RNA的提取  24
    3.2.2 引物的合成  24
    3.2.3 样本DNA以及RNA的PCR检测  24-25
    3.2.4 伯氏疏螺旋体以及立克次体PCR产物纯化  25
    3.2.5 连接纯化好的PCR产物和T载体  25
    3.2.6 感受态细胞的制备以及质粒的重组  25-26
    3.2.7 PCR产物测序  26
  3.3 结果与分析  26-27
  3.4 讨论  27-29
第四章 Q热立克次体SOUTHERN BLOT  29-33
  4.1 试验材料  29
  4.2 试验方法  29-31
  4.3 结果与分析  31-32
  4.4 讨论  32-33
第五章裂谷热病原荧光定量PCR方法的建立  33-40
  5.1 试验材料  33
  5.2 试验方法  33-36
  5.3 结果与分析  36-38
    5.3.1 引物、探针的浓度以及退火温度的优化  36-37
    5.3.2 最佳阈值  37
    5.3.3 灵敏度的检测  37-38
    5.3.4 特异性检验  38
  5.4 讨论  38-40
第六章结论  40-41
参考文献  41-46
附录  46-47
致谢  47
作者简介  47-49
附件  49

东北地区蜱传病原多样性调查以及检测方法的建立

内容摘要

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