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皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪种群建立及其异种移植研究

作　者: 江雯
导　师: 魏泓
学　校: 第三军医大学
专　业: 动物学
关键词: hCTLA-4Ig 转基因角蛋白皮肤异种移植
分类号: S828
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

一、背景CTLA-4Ig(human cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen4-immunoglobulin)是CTLA-4分子的细胞外功能区与人免疫球蛋白IgG1恒定区相结合的融合蛋白。它是功能明确、经典的免疫抑制分子，可与B7结合，阻断CD28/B7正性共刺激信号通路，诱导T细胞免疫无反应。许多研究都证实了其可以延长移植物存活时间。本实验室前期与西南医院烧伤研究所吴军教授课题组合作，利用hCTLA-4Ig基因重组腺病毒体外感染非转基因猪皮肤，成功研制了离体基因修饰活性皮肤[1]，也有效延长了活性猪皮肤在人体创面的存活时间。然而，全身性表达CTLA-4Ig的转基因动物难以成活。研究报道敲除CTLA-4基因的小鼠及全身高表达pCTLA-4Ig的转基因猪都在出生后不久死亡，提示CTLA-4Ig对转基因动物自身免疫功能有一定的影响，若调控性、限制性的表达CTLA-4Ig可能会降低该蛋白对转基因动物全身免疫功能的影响，提高制备转基因动物的成功率。大面积烧伤病人由于自体及异体皮肤不足以满足移植需要，猪皮肤作为临时替代和覆盖物已在临床上应用。皮肤是非血管化器官，其移植后的排斥反应主要以细胞排斥为主。根据本实验室前期的实验，以hCTLA-4Ig腺病毒体外修饰的基因转染猪皮能够显著延长其猪皮在烧伤病人创面存活时间，但体外病毒转染方法为单次转染单次应用，涉及病毒制备及转染工艺，成本高、工艺复杂、效率低、稳定性差、质量控制难度高。因此，构建皮肤靶向表达hCTLA-4Ig并可稳定遗传的转基因猪群体或品系作为皮肤供体，可望形成稳定、高效、经济的异种移植皮肤来源。巴马香猪是我国小型猪群体中唯一具有白色被毛的品系，且体表白毛面积大、繁殖力强、抗病力强、性格温驯，生物学特性明确，是适合的医学实验动物。利用标准化的巴马香猪构建转基因猪种群，可望提高转基因猪品系或群体的标准化、提高供体猪皮肤一致性，从而提高模型研究科学性、产品稳定性。研制皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪是本实验研究最终目的。但由于构建转基因猪周期长、成本高、风险大，而小鼠繁殖力强、世代间隔短、研究时间短、经济成本低，因此在构建转基因猪以前构建转基因小鼠有利于提高研究的可控性。同时，构建小鼠、猪的皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因动物模型，形成从小动物到大动物的模型体系，更有助于深入、系统研究hCTLA-4Ig及其在异种移植中的作用及机理。二、目的（一）建立小鼠、猪的皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因动物模型，为系统研究hCTLA-4Ig分子对异种皮肤移植排斥反应的调控功能，提供从小动物（小鼠）到大动物（猪）的模型体系。（二）建立皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪群体，为研制高效、稳定、经济的异种移植皮肤产品形成基础。三、方法（一）皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因小鼠制备、种群建立及其功能验证通过慢病毒载体的方法构建皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因小鼠，并建立封闭繁育群体；用PCR方法进行阳性小鼠的筛选和鉴定；用RT-PCR、real time PCR、ELISA、WB和免疫组化的方法研究转基因蛋白在小鼠体内的表达和分布；用单向MLC的方法，研究该转基因蛋白在体外的生物活性；用小鼠→大鼠异种皮肤移植实验模型，观察移植皮肤的存活状况、时间，研究该转基因蛋白在体内的生物学活性。（二）皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪的构建以体细胞核移植方法构建皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪；以PCR方法进行转基因阳性猪筛选和鉴定；以WB方法初步分析转基因猪体内该蛋白的表达和分布。（三）皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪种群建立及其异种移植研究通过体细胞核移植的方法构建皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪，并形成封闭繁育群体；用PCR方法进行阳性转基因猪的筛选和鉴定；以ELISA和WB的方法研究转基因蛋白在猪体内的表达和分布；以单向MLC的方法，研究该转基因蛋白在体外的生物活性；以猪→大鼠异种皮肤移植实验模型，观察移植皮肤的存活状况、时间，研究该转基因蛋白在体内的生物学活性；以病理切片HE染色来观察皮肤移植后的组织学变化。四、结果（一）建立了皮肤靶向表达hCTLA-4Ig的转基因小鼠种群，并证实了该转基因蛋白在小鼠皮肤组织的特异性表达及其生物学活性。根据PCR结果证实本实验获得8只hCTLA-4Ig转基因首建小鼠，转基因首建鼠的得率（转基因首建小鼠数/注射转染的胚胎数）是6.3%；并且通过这8只转基因首建小鼠的横交繁殖、PCR筛选，建立了皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因小鼠种群；RT-PCR和Western blot分析表明，hCTLA-4Ig蛋白实现了在转基因小鼠皮肤中的特异性表达，且表达水平较高；免疫组化分析也表明，hCTLA-4Ig在皮肤中的特异性表达，且该转基因蛋白的表达对皮肤组织的正常发育和组织形态没有明显影响；ELISA分析表明，hCTLA-4Ig蛋白因其呈可溶性表达，在转基因小鼠血清中也有明显的分布，其浓度达11.87μg/ml；在单向MLC实验中，小鼠血清中转基因表达的hCTLA-4Ig蛋白明显抑制了人淋巴细胞混合培养系统中反应细胞的增殖，其程度与相同终浓度的纯化重组蛋白hCTLA-4Ig相当；在小鼠→大鼠皮肤移植实验中，hCTLA-4Ig转基因小鼠的皮肤比相同品系野生型小鼠皮肤在受体的存活时间明显延长。（二）获得了皮肤靶向表达hCTLA-4Ig的转基因巴马香猪种群，并证实了该转基因蛋白在巴马香猪皮肤组织的特异性表达及其生物学活性。成功获得了皮肤靶向表达hCTLA-4Ig的转基因克隆巴马香猪，首建猪得率是0.75%；通过转基因首建巴马香猪与野生型巴马香猪繁殖获得的F1代进行横交繁殖，经PCR筛选，建立了皮肤靶向表达hCTLA-4Ig的转基因巴马香猪种群；对F1代转基因猪进行PCR鉴定，在出生的59头F1代猪中有32头阳性（54.2%）；ELISA分析表明，hCTLA-4Ig蛋白因其呈可溶性表达，在转基因巴马猪血清中也有明显的分布，随机选取的5头F1代转基因巴马香猪血清中hCTLA-4Ig蛋白的浓度在5.61～9.56μg/ml之间；Western blot分析表明，hCTLA-4Ig蛋白在转基因猪的皮肤、角膜都有表达，但其表达水平稍低于内参基因GAPDH，而野生型巴马香猪的皮肤没有明显的表达条带；在单向MLC实验中，猪血清中转基因表达的hCTLA-4Ig蛋白明显的抑制了人淋巴细胞混合培养系统中反应细胞的增殖，其程度与相同终浓度的纯化重组蛋白hCTLA-4Ig相当；在猪→大鼠皮肤移植实验中，hCTLA-4Ig转基因巴马香猪皮肤比野生型猪皮肤异种移植到大鼠背部后存活时间延长；组织石蜡切片HE染色结果发现，宿主对移植物的反应程度具有差异，对转基因猪皮肤的炎症反应明显低于对野生型猪皮肤。五、结论（一）成功建立了皮肤靶向表达hCTLA-4Ig的转基因小鼠和转基因巴马香猪种群，通过体内外实验证实了转基因小鼠和转基因巴马香猪体内表达的转基因蛋白hCTLA-4Ig的生物学活性，为深入、系统研究hCTLA-4Ig及其在异种移植中的作用及机理，形成了从小动物到大动物的模型体系。（二）建立了皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪种群，其种群可望成为临床异种移植供体皮肤来源，为研制高效、稳定、经济的异种移植皮肤产品形成基础。

皮肤靶向表达hCTLA-4Ig转基因巴马香猪种群建立及其异种移植研究

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