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奶牛瘤胃微生物蛋白酶和二肽基肽酶Ⅳ基因的筛选与多样性分析

作　者: 赵静雯
导　师: 王加启
学　校: 中国农业科学院
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 奶牛瘤胃微生物元基因组学蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ 多样性
分类号: S823
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

在日粮蛋白质的降解过程中，蛋白酶是蛋白质水解为肽或氨基酸的关键酶，由于受到纯培养技术的影响，瘤胃内分泌蛋白酶的细菌和各种蛋白酶的基因信息知之甚少。本试验旨在利用蛋白酶选择性培养基从瘤胃微生物Fosmid文库中筛选出含蛋白酶活性的克隆子，通过生物信息学分析获得这些克隆子的基因信息。应用脱脂乳粉和大豆蛋白粉两种蛋白酶选择性培养基，从30000个克隆中筛选得到14个具有蛋白酶活性的阳性克隆。利用福林酚试剂法检测14个蛋白酶克隆子的酶活力，结果表明每个克隆子分别具有不同的蛋白质分解能力。以酪蛋白为底物的克隆子酶活力介于0.59-2.74U/mg之间；以大豆蛋白粉为底物的克隆子酶活力在0.70-7.19U/mg之间。pro10F末端序列与金属肽酶匹配度为54%，属于肽酶M13家族，且该克隆蛋白酶最适pH值为7.0。选取两个克隆利用鸟枪测序法进行测序，经GenMark分析，共获得了53个不同的蛋白序列，其中有两个属于不同的肽酶家族的序列片段。为了研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidases Ⅳ，DPP-Ⅳ）的序列特征和酶学性质，从奶牛瘤胃微生物Fosmid文库中利用简并引物筛选含DPP-Ⅳ的阳性克隆。提取阳性克隆粗酶液，利用Gly-Pro-pNA底物检测肽酶活性。筛选后获得10个含有DPP-Ⅳ的阳性克隆（命名为DP1-DP10）。Fosmid末端序列经BLASTX比对后，结果表明78%的序列可以与数据库的已知序列相匹配，但相似度变化较大（44%-94%）。DPP-Ⅳ序列经BioEdit比对后，结果表明均含有N端保守区域（D-W-V-Y-E-E-E）和C端催化区域（G-W-S-Y-G-G）。酶活力检测发现DP7肽酶活力最高，为6.88U·mg-1。提取质粒等量混合后用Illumina HiSeq2000进行建库测序，经过Glimmer软件分析，获得3591个基因，对这些基因进行功能注释，发现参与多种代谢途径的基因，尤其是参与蛋白质降解过程的基因，其中存在两个不同的DPP-Ⅳ基因，为瘤胃蛋白质代谢的进一步研究提供了基础信息。选取10个阳性克隆中粗酶液活性最高的克隆DP7进行DPP-Ⅳ基因的研究。利用已有DP7中DPP-Ⅳ基因的序列两端设计引物，对DP7质粒进行直接测序，并对DPP-Ⅳ基因进行原核表达。结果发现DP7克隆中DPP-Ⅳ基因全长为2298bp，可编码756个氨基酸残基。利用预测的DPP-Ⅳ基因序列与GenBank数据库中的序列进行BLASTP比较，发现相似性最高的序列来源于Pontibacter sp的序列（46%），依次是Sphingobacterium sp（46%）、Solitalea canadensis（46%）、Marinilabilia sp（45%）和Cecembia lonarensi（s45%）。该序列具有DPP-Ⅳ三联体的催化结构（Ser633、Asp708和His740），且比其他的序列多了一段从422位到425位插入的氨基酸序列，说明该序列是一种新的DPP-Ⅳ基因序列。对该序列设计表达引物进行序列扩增，获得DPP-Ⅳ基因表达序列，经原核表达和纯化后，获得了DP7克隆中DPP-Ⅳ的目的蛋白，可继续进行DPP-Ⅳ酶学性质的研究。为了解豆粕降解菌中DPP-Ⅳ基因的序列结构多样性，本试验利用尼龙袋法分别收集0、12、24和48h豆粕降解菌，提取总DNA，PCR扩增16S rDNA V3区进行变性梯度凝胶电泳分析，结果表明与0h相比，12、24和48h的豆粕降解菌存在明显的变化，0h细菌的菌群条带比其他时间点的菌群条带丰富。选取12h的豆粕降解菌作为DPP-Ⅳ基因简并引物的扩增模板，PCR产物克隆测序后，获得5个克隆的DPP-Ⅳ基因序列；经BioEdit软件对序列进行比对，分析发现这5条序列存在DPP-Ⅳ的保守区序列（D-W-V-Y-E-E-E），但催化区（G-X-S-X-X-G）存在S→T或S→R的变异。对不同时间点的豆粕降解菌DNA混合样品进行DPP-Ⅳ全长基因的扩增，获得20个克隆的DPP-Ⅳ基因的全长序列。20个克隆中DPP-Ⅳ基因序列长度均为2193bp，都具有DPP-Ⅳ的活性位点序列（G-X-S-X-X-G）和催化三联体结构，但在保守序列（D-W-V-N-E-E-E）区出现2个变异位点（V→A和N→S）。这4个变化位点的存在是否影响DPP-Ⅳ的酶活性有待进一步研究。为了揭示体外培养条件下厌氧培养菌中DPP-Ⅳ基因多样性及莫能菌素对产生DPP-Ⅳ基因细菌的影响，本试验以酪蛋白为唯一氮源（P组），另一组在以酪蛋白为唯一氮源的基础上添加莫能菌素（M组），分别接种瘤胃液后，进行厌氧培养。培养12h后，收集培养液中的微生物，提取基因组DNA。利用设计的DPP-Ⅳ基因引物，通过PCR构建DPP-Ⅳ基因文库，挑取克隆测序后，获得66条DPP-Ⅳ基因序列；经Mothur软件分析发现23个OTU，其中OTU9可能是对莫能菌素敏感的蛋白降解菌的DPP-Ⅳ基因。对P和M组的厌氧培养菌进行DPP-Ⅳ基因的定量研究，发现P组的DPP-Ⅳ基因的拷贝数极显著高于M组（P<0.01）。这些结果表明莫能菌素影响了产DPP-Ⅳ细菌的数量。

奶牛瘤胃微生物蛋白酶和二肽基肽酶Ⅳ基因的筛选与多样性分析

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