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枣两个木质素合成相关基因的克隆及表达分析

作　者: 谭洪花
导　师: 房经贵; 曹尚银
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 枣木质素合成克隆表达
分类号: S665.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 32次
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内容摘要

枣果核硬化是由石细胞造成的,而木质素是石细胞的主要成分,因此有关木质素合成所需关键酶基因的研究对揭示枣果核发育有重要意义。本研究从‘金丝小枣’、‘无核小枣’中克隆了与木质素合成相关的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase)基因的cDNA序列,发现两基因在‘金丝小枣’及‘无核小枣’中的序列相同,另外,分别研究了PAL、PPO基因在四个不同时期的金丝小枣的果核、果肉与无核小枣果核中转录水平上的表达情况。1.枣木质素合成相关基因的克隆及序列分析本文以‘金丝小枣’和‘无核小枣’为试验材料,根据NCBI上登录的该基因的保守区设计特异引物或简并引物,通过RT-PCR扩增获得基因保守片段,再利用RACE技术从枣中克隆了苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase)基因部分cDNA序列及多酚氧化酶(polyphenoloxidase)基因全长。枣苯丙氨酸解氨酶基因的GenBank登录号为HQ616101,命名为ZjPAL。ZjPAL长度为1955bp,包含246bp的3’非转译区(3’UTR)和27bp的Ploy(A)尾巴,编码559个氨基酸,氨基酸同源比对结果表明,ZjPAL所编码的氨基酸序列与蓖麻(XP002531677.1)、花叶木薯(AAK62030.1)、毛果杨(ACC63889.1)、葡萄(XP002272887.1)、柠檬(AAB67733.1)、白梨(ADF59062.1)PAL基因同源性分别为92%、91%,90%、89%、89%、88%。对所编码的部分蛋白预测分析发现ZjPAL含有PAL-HAL和Lyase-1-like superfamily两个结构功能域。枣多酚氧化酶基因的GenBank登录号为HQ634289,命名为ZjPPD。其cDNA全长序列为1954bp,其中5’非翻译区为2bp,3’非翻译区为145bp,Ploy(A)尾巴为23bp,开放阅读框为1785bp,编码594个氨基酸。推导氨基酸分子量为66.43KDa,pI为8.23,同源比对结果表明ZjPPO基因编码的氨基酸序列与榅桲(ABY84850.1)、草莓(ADI44161.1)、核桃(ACN86310.1)、沙梨(BAB64530.1)、李(AAW65103.1)、苹果(B21676.1)、白梨(ABS88291.1)、莲(ADP89908.1)PPO基因序列同源性分别为71%、70%、65%、68%、69%、68%、66%、68%。对所编码的蛋白预测分析发现ZjPPO含有PPO1-KFDV、Tyrosinase、PPO1-DWL三个超家族结构功能域。2.Real-time PCR分析ZjPAL、ZjPPO基因的表达采用实时荧光定量PCR技术,分别分析了ZjPAL、ZjPPO基因在四个不同时期的金丝小枣果核、果肉与无核小枣果核中的表达差异,结果表明ZjPAL、ZjPPO在无核小枣与金丝小枣果核内的表达趋势一致,都是先上升后下降,最后趋于平缓,并且均在果重0.4g时达高峰,但在无核小枣果核中的表达量低于金丝小枣。金丝小枣果肉中的ZjPAL基因表达趋势与果核存在差异,其在果重0.1g时达高峰,之后趋于下降趋势；而ZjPPO基因表达趋势与果核中一致,在果重0.4g时达高峰,之后呈下降趋势。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语  10-11
前言  11-12
第一章文献综述  12-20
  1. 枣果核发育的研究  12-13
    1.1 枣果核发育  12
    1.2 枣果核发育与木质素  12-13
    1.3 枣果核发育与激素  13
  2. 木质素代谢研究进展  13-19
    2.1 木质素的结构与种类  13-14
    2.2 木质素代谢途径  14-15
    2.3 木质素合成的相关酶类  15-19
      2.3.1 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)  16-17
      2.3.2 多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)  17
      2.3.3 过氧化物酶(peroxidase,POD)  17-18
      2.3.4 生长素氧化酶(Indoleacetic acid oxidase,IOD)  18-19
  3 研究目的及意义  19-20
第二章枣PAL、PPO基因的克隆及生物信息学分析  20-44
  摘要  20
  1 试验材料  20-21
    1.1 试验材料  20
    1.2 菌体  20
    1.3 引物  20-21
    1.4 主要试剂  21
    1.5 实验仪器  21
  2 试验方法  21-27
    2.1 试验材料RNA的提取  21
    2.2 cDNA的合成  21-22
      2.2.1 RNA纯化  21-22
      2.2.2 cDNA合成  22
    2.3 PCR扩增体系、程序及琼脂糖电泳  22-24
    2.4 PCR扩增目的片段产物回收  24
    2.5 目的片段与T-载体的连接  24
    2.6 连接产物转化(热激法)、涂板及菌液培养  24-25
    2.7 RACE(rapid amplification of cDNA ends)末端片段扩增  25-27
  3 结果与分析  27-41
    3.1 枣果实RNA提取  27-28
    3.2 PAL基因的克隆及序列分析  28-34
      3.2.1 PAL基因的克隆  28-29
        3.2.1.1 PAL基因保守片段的扩增  28
        3.2.1.2 PAL基因cDNA 3’末端的克隆  28-29
      3.2.2 ZjPAL序列分析  29-33
      3.2.3 ZjPAL聚类分析  33-34
    3.3 PPO基因的克隆及序列分析  34-41
      3.3.1 PPO基因的克隆  34-35
        3.3.1.1 PPO基因保守片段的扩增  34
        3.3.1.2 PPO基因3’、5’末端的克隆  34-35
        3.3.1.3 PPO基因cDNA全长序列的获得  35
      3.3.2 ZjPPO序列分析  35-40
      3.3.3 ZjPPO聚类分析  40-41
  4 讨论  41-44
第三章枣PAL、PPO基因的表达分析  44-54
  摘要  44
  1 材料  44-45
    1.1 试验材料  44-45
    1.2 主要试剂  45
    1.3 主要仪器  45
  2 方法  45-46
    2.1 引物设计  45
    2.2 总RNA提取  45
    2.3 cDNA合成  45-46
    2.4 Real-time PCR  46
      2.4.1 荧光定量PCR反应体系  46
      2.4.2 荧光定量PCR反应程序  46
  3 结果与分析  46-52
    3.1 管家基因ZjH_3 RT-PCR扩增  46-47
    3.2 ZjPAL实时荧光相对定量分析  47-50
    3.3 ZjPPO实时荧光相对定量分析  50-52
  4 讨论  52-54
全文结论  54-56
创新点  56-58
参考文献  58-64
附录  64-70
  附录1：本论文中所用储备液及培养基的配置  65-66
  附录2：RACE技术的原理  66-67
  附录3：荧光定量2~(-(ΔΔCt))算法  67-70
攻读硕士期间发表的论文或待发表的论文  70-72
致谢  72

枣两个木质素合成相关基因的克隆及表达分析

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