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锥栗花序cDNA-AFLP体系建立与LFY基因的克隆

作　者: 郜祥雄
导　师: 郑诚乐
学　校: 福建农林大学
专　业: 果树学
关键词: 锥栗 RNA 花序 cDNA-AFLP LFY基因
分类号: S664.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 100次
引　用: 2次
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内容摘要

锥栗(Castanea henryi Rehd&Wils.)，属山毛榉科栗属植物，营养价值高，是福建北部特有产品和天然绿色食品。由于花期授粉不良和花期营养不良，常导致锥栗空棚。锥栗花序的生长发育状况是开花的重要前提，而雄花序过多，使锥栗营养流失严重，落花落果严重，最终导致低产。本研究以锥栗花序为材料，建立锥栗cDNA-AFLP技术体系，找出与花序分化相关的差异基因，克隆锥栗LFY基因，为解决锥栗花序分化与调控及缩短童期，提供理论依据。主要试验结果如下：1建立适合锥栗花序总RNA提取的方法采用两种植物RNA快速提取试剂盒、改良Trizol法和改良CTAB法提取锥栗花序总RNA。对比试验结果，表明：改良后CTAB法最合适，所得的总RNA产量高、比较纯净、完整，可用于后续的逆转录反应。2建立锥栗花序的cDNA-AFLP技术体系采用EcoRI和MseI进行双酶切，选用8条EcoRI引物和8条MseI引物，共组合成64对引物对进行选择性扩增，最后确定适合锥栗花序的cDNA-AFLP体系，20μl体系中，模板30ng、引物各1μl、10mM dNTPmix需要0.2μl、10×Ex-taq buffer需2μl和Ex-Taq(5U/μl)需要0.1μl。试验共回收20条差异条带，经二次扩增后再次回收，并进行载体连接后测序，通过NCBI进行blastn或blastp，共获得10条同源性高的序列。3锥栗花序LFY基因的克隆根据板栗LFY基因序列，在其ORF区设计上下游引物，扩增得到锥栗花序LFY基因片段1111bp，再根据此序列设计3’RACE引物，克隆得到锥栗花序LFY基因的3’端，最后拼接获得1389bp的序列，通过NCBI进行blastn和blastp，可知与板栗（ABB83126.1）同源性达99%。该基因序列已在GenBank进行登录，登录号为：JQ825167。

全文目录

缩略词汇总  8-10
摘要  10-11
Abstract  11-13
第一章引言  13-25
  1 锥栗研究现状  13-14
  2 开花相关基因的研究  14-18
    2.1 植物成花途径及基因分类  14-17
      2.1.1 控制开花时间的基因  15-16
      2.1.2 花分生组织特征基因  16-17
      2.1.3 花器官特征基因  17
      2.1.4 定域基因  17
    2.2 LFY 基因及其同源基因的作用  17-18
  3 基因差异表达所用的分离方法  18-22
    3.1 DDRT-PCR 技术  18-19
    3.2 RDA 技术  19
    3.3 SSH 技术  19
    3.4 SAGE 技术  19-20
    3.5 cDNA 微列阵（cDNA microarray）  20
    3.6 cDNA-AFLP 技术  20-22
  4 研究意义  22-23
  5 研究路线  23-25
第二章锥栗花序总 RNA 提取及 cDNA-AFLP 体系建立  25-49
  1 试验材料  25-26
    1.1 植物材料的准备  25
    1.2 仪器及耗材  25-26
    1.3 主要生化试剂  26
  2 试验方法  26-36
    2.1 锥栗花序总 RNA 的提取  26-27
      2.1.1 改良 CTAB 法  26-27
      2.1.2 其它总 RNA 提取法  27
    2.2 cDNA 第一链的合成  27-28
    2.3 cDNA 第二链的合成及纯化  28
      2.3.1 双链 cDNA 的的合成  28
      2.3.2 双链 cDNA 的纯化  28
    2.4 酶切与接头连接  28-29
    2.5 预扩增  29-30
    2.6 选择性扩增体系的筛选  30-32
      2.6.1 模板浓度筛选  31
      2.6.2 dNTP 浓度筛选  31-32
    2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳  32-33
      2.7.1 丙烯酰胺凝胶的制备  32
      2.7.2 胶板处理  32
      2.7.3 灌胶  32
      2.7.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳  32-33
    2.8 银染  33
      2.8.1 脱色  33
      2.8.2 染色  33
      2.8.3 显影  33
    2.9 差异条带的回收纯化与测序分析  33-36
      2.9.1 二次扩增  34
      2.9.2 PCR 产物的回收纯化  34-35
      2.9.3 平板制作  35
      2.9.4 载体连接  35
      2.9.5 转化  35-36
      2.9.6 摇菌及菌液验证  36
    2.10 cDNA 的测序工作及序列的分析  36
  3 结果与分析  36-43
    3.1 锥栗花序总 RNA 提取  36-38
    3.2 二次模板的检测  38-39
    3.3 选择性扩增的模板浓度、dNTP 浓度的筛选  39-40
    3.4 聚丙烯酰胺凝胶差异片段的选择  40-41
    3.5 二次扩增的琼脂糖胶检测  41
    3.6 测序结果及功能分析  41-43
  4 讨论  43-49
    4.1 总 RNA 的提取  43-45
    4.2 酶切的关键性  45
    4.3 体系构建  45-46
    4.4 电泳及银染的注意细节  46-47
    4.5 差异片段测序结果讨论  47-49
第三章 LFY 基因的克隆  49-63
  1 试验材料  49
    1.1 植物材料的准备  49
    1.2 仪器及耗材  49
    1.3 主要生化试剂  49
  2 试验方法  49-53
    2.1 LFY 基因片段的克隆  49-51
      2.1.1 锥栗花序总 RNA 的提取  49
      2.1.2 逆转录  49
      2.1.3 引物设计  49-50
      2.1.4 LFY 基因片段的 PCR 扩增  50
      2.1.5 连接转化  50
      2.1.6 摇菌及菌液验证  50-51
      2.1.7 测序及分析（方法同第二章 2.10）  51
    2.2 RACE 克隆  51-53
      2.2.1 3'RACE 的引物  51
      2.2.2 3'RACE 所需 cDNA 的准备  51
      2.2.3 3'RACE 的首轮 PCR 扩增  51-52
      2.2.4 3'RACE 的次轮 PCR 扩增  52
      2.2.5 条带回收  52
      2.2.6 连接及转化  52
      2.2.7 摇菌及菌液验证  52
      2.2.8 测序及分析  52-53
  3 结果与分析  53-61
    3.1 LFY 基因片段的克隆  53-54
    3.2 LFY 基因片段 3'RACE  54-55
      3.2.1 首轮扩增  54-55
      3.2.2 次轮扩增  55
    3.3 测序结果与分析  55-61
      3.3.1 锥栗花序 LFY 基因片段测序结果分析  55-57
      3.3.2 3'RACE 的测序结果分析  57-58
      3.3.3 拼接  58-61
  4 讨论及展望  61-63
参考文献  63-73
附录（试验药品配方及使用说明、图片）  73-79
致谢  79

锥栗花序cDNA-AFLP体系建立与LFY基因的克隆

内容摘要

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