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葡萄两个重要SBP基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

作　者: 曹雪
导　师: 房经贵
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄 SBP 克隆亚细胞定位表达
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

葡萄属于葡萄科葡萄属植物,是世界性重要果树之一。其基因组较小(约为500Mbp),大约是拟南芥基因组大小的3到4倍,同时也是继拟南芥、水稻、杨树之后完成全基因测序的第四种开花植物,因此葡萄已成为分子生物学研究的重点对象。真核生物转录因子是近几十年来发现的一类在真核基因转录时起调节作用的蛋白质,有关研究相继从高等植物中分离出一系列调控发育及逆境反应等相关基因表达的转录因子。SBP转录因子是高等植物所特有的一类转录因子,该家族具有许多重要的生物学功能,例如：其在植物的生长发育过程中起重要作用。而关于葡萄SBP转录因子家族的研究才刚刚起步,为进一步探索SBP转录因子家族的结构与功能,本研究利用生物信息学对葡萄SBP家族进行了分析,并利用电子克隆及3’RACE技术克隆了夏黑葡萄SBP家族两个基因Vv-SPL9和Vv-SPL10的cDNA全长,构建了亚细胞定位表达载体,对其是否具有核定位功能的进行了研究,采用半定量和荧光定量RT-PCR方法分析这基因在葡萄不同组织中的表达情况,同时研究了microRNA156a (Vv-miR156a)与这两个基因表达之间的关系,对葡萄SBP家族的这两个基因有了初步的认识,重要研究结果如下：1.葡萄SBP基因家族生物信息学分析,根据拟南芥SBP保守区域的蛋白序列在NCBI中检索相匹配的序列,之后利用Pfam软件检索葡萄无冗余蛋白质数据库,共得到45条葡萄候选SBP氨基酸序列,其中近半数具有葡萄microRNA156a(Vv-miR156a)识别位点,之后又进行了基因定位、氨基酸组成成分、理化性质及空间结构分析,对葡萄SBP基因家族的性质有了初步认识。2.利用电子克隆及3’RACE技术获得了葡萄两个SBP类转录因子基因Vv-SPL9和Vv-SPL10的cDNA全长,登录号分别为HM018600和HM018601,cDNA全长分别为1649bp和1709bp。经序列分析发现这两个基因编码的蛋白质均具有SBP转录因子的典型特征,证明从葡萄上成功地分离出了拟南芥SPL9和SPL10的同源基因Vv-SPL9和Vv-SPL10。3.构建了Vv-SPL9和Vv-SPL10GFP表达载体,并进行了亚细胞定位分析。结果显示两者都仅在核内产生绿色荧光,即表明Vv-SPL9和Vv-SPL10均具有核定位功能。4.利用半定量和荧光定量RT-PCR技术分析了Vv-SPL9、Vv-SPL10和Vv-miR156a在葡萄不同组织中的表达,结果显示这两个基因在各个组织中均有表达,但量存在差异,两者均在幼果中的表达量最高,中果及大果中渐弱,表明这两个基因与果实的发育有关,同时它们的表达还受Vv-miR156a的调控。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词（Abbreviation)  11-13
前言  13-14
第一章文献综述  14-24
  1 转录因子研究进展  14-19
    1.1 转录因子的结构  15-16
      1.1.1 DNA结合区  15
      1.1.2 转录调控区  15-16
      1.1.3 核定位信号区  16
      1.1.4 寡聚化位点区  16
    1.2 转录因子的分类  16-17
    1.3 转录因子的功能  17-19
      1.3.1 转录因子与植物生长发育和形态建成  17-18
      1.3.2 转录因子与植物抗逆性  18-19
      1.3.3 转录因子与植物的次生代谢  19
  2 SBP类转录因子研究进展  19-21
    2.1 SBP基因家族的发现  19-20
    2.2 SBP基因家族的结构  20
    2.3 SBP基因家族的功能  20-21
  3 电子克隆与RACE技术  21-23
    3.1 电子克隆方法  21-22
    3.2 cDNA末端快速扩增技术  22-23
  4 小结与展望  23-24
第二章葡萄SBP基因家族生物信息学分析  24-34
  摘要  24-25
  1 材料与方法  25-26
    1.1 蛋白序列  25
    1.2 应用软件及分析  25-26
      1.2.1 序列分析  25
      1.2.2 蛋白质结构分析  25-26
      1.2.3 MiR156靶序列的定位  26
  2 结果与分析  26-33
    2.1 葡萄SBP挖掘  26
    2.2 葡萄SBP蛋白的系统发生分析  26
    2.3 葡萄SBP基因组定位  26-27
    2.4 氨基酸组成成分及理化性质分析  27
    2.5 二级和三级结构预测与分析  27
    2.6 MiR156靶序列的定位  27-33
  3 讨论  33-34
第三章葡萄SPL9和SPL1O基因的克隆与序列分析  34-46
  摘要  34
  1 材料与方法  34-40
    1.1 材料  34-36
      1.1.1 植物材料  34-35
      1.1.2 菌株及载体  35
      1.1.3 化学试剂、酶制剂及试剂盒  35
      1.1.4 培养基及溶液  35
      1.1.5 引物  35-36
    1.2 方法  36-40
      1.2.1 总RNA的提取  36
      1.2.2 总RNA的纯化  36-37
      1.2.3 cDNA的合成  37
      1.2.4 引物设计  37-38
      1.2.5 葡萄SPL9和SPL10基因ORF、3’和5’的克隆  38
      1.2.6 PCR产物的回收  38-39
      1.2.7 目的片段T载体的连接,转化及鉴定  39
      1.2.8 葡萄SPL9和SPL10全长cDNA序列获得  39
      1.2.9 生物信息学分析  39-40
  2 结果与分析  40-44
    2.1 总RNA的提取  40
    2.2 葡萄Vv-SPL9和Vv-SPL10 cDNA全长的电子克隆  40
    2.3 葡萄Vv-SPL9和Vv-SPL10 cDNA全长的获得  40-41
    2.4 葡萄Vv-SPL9和Vv-SPL10氨基酸序列分析  41-44
  3 讨论  44-46
第四章葡萄SPL9和SPL10基因的亚细胞定位分析  46-52
  摘要  46
  1 材料与方法  46-51
    1.1 材料  46-47
      1.1.1 植物材料  46
      1.1.2 试剂及溶液  46-47
      1.1.3 菌株及载体  47
      1.1.4 培养基  47
    1.2 方法  47-51
      1.2.1 总RNA的提取及纯化  47
      1.2.2 cDNA的合成  47
      1.2.3 引物设计  47-48
      1.2.4 克隆  48
      1.2.5 质粒提取  48-49
      1.2.6 表达载体的构建  49-50
      1.2.7 基因枪转化  50
      1.2.8 玻片制备和样品观察  50-51
  2 结果与分析  51
  3 讨论  51-52
第五章葡萄SPL9和SPL10基因表达分析  52-62
  摘要  52-53
  1 材料与方法  53-57
    1.1 材料  53-54
      1.1.1 植物材料  53
      1.1.2 试剂  53
      1.1.3 引物  53-54
    1.2 方法  54-57
      1.2.1 总RNA的提取  54
      1.2.2 总RNA的纯化  54
      1.2.3 葡萄LMW RNA的分离  54-55
      1.2.4 cDNA的合成  55-56
      1.2.5 引物设计  56
      1.2.6 Vv-SPL9和Vv-SPL10半定量PCR扩增  56-57
      1.2.7 Vv-SPL9、Vv-SPL10及Vv-miR156a荧光定量PCR扩增  57
  2 结果与分析  57-59
    2.1 Vv-SPL9和Vv-SPL10在葡萄不同组织中的半定量PCR表达分析  57-58
    2.2 Vv-SPL9、Vv-SPL10及Vv-miR156a在葡萄不同组织中的定量表达分析  58-59
  3 讨论  59-62
全文结论  62-64
创新点  64-66
参考文献  66-74
附录本文中常用试剂及培养基的配置  74-76
攻读硕士学位期间发表论文情况  76-78
致谢  78

葡萄两个重要SBP基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

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