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陆地棉抗黄萎病相关基因筛选及功能验证

作　者: 张文蔚
导　师: 徐世昌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 陆地棉黄萎病抗病基因表达谱病毒诱导的基因沉默
分类号: S435.621
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的棉花黄萎病是一种土传性真菌维管束病害，是影响我国和世界棉花生产的最重要病害。其防治难度大，至今尚无理想的防治药剂，种植抗病品种是最为经济有效的方法。但陆地棉抗黄萎病机制复杂不清，抗病育种工作难度大。为此，开展陆地棉抗黄萎病机理研究，对抗病相关基因进行功能分析，将为通过基因工程手段培育抗病品种提供重要的工作基础和理论依据。本研究以本组培育的陆地棉高抗黄萎病新品系中植棉KV1为材料，分别提取接种大丽轮枝菌强致病力落叶型菌株V991后0-96h棉株幼根总RNA，构建正、反向抑制差减杂交文库，经反向Northern杂交，筛选到147个信号强度差异明显的克隆，其中141条为高质量的EST序列，包括99个unigenes和42条重复序列。99个unigenes中包含92个上调表达基因和7个下调表达基因，涉及抗病及胁迫、蛋白质合成、信号传导、转录因子、代谢及次生代谢、细胞壁骨架、未知功能及新基因九大类功能，建立了黄萎病菌侵染初期陆地棉的抗病相关基因表达谱。其中Bet v1基因家族和UbI基因家族的基因高频表达，推测它们在陆地棉抗黄萎病的防卫反应和早期抗病信号传导途径中起重要作用。荧光定量PCR测定结果显示，5个Bet v1基因、2个UbI基因和1个衰老相关基因在接菌的抗病品种中植棉KV1与感病品种鄂荆1号中，表达量具有显著性差异。棉花皱缩病毒诱导的VIGS技术为棉花抗病相关基因的功能验证提供了一个高效的技术平台。利用病毒诱导的基因沉默技术，在中植棉KV1中成功地沉默了与陆地棉抗病相关的2个泛素连接酶基因GhUbI1、GhSCF和1个功能未知基因GhEG。对沉默植株接种大丽轮枝菌V991，抗病性鉴定结果显示，野生型的中植棉KV1和转化空载体棉株的病情指数分别为17.47和19.64，沉默GhUbI1基因、GhEG基因和GhSCF基因的棉株病情指数分别为55.0、51.79和44.05。GhUbI1基因、GhEG基因和GhSCF基因沉默后，中植棉KV1对黄萎病的抗性丧失，证明了GhUbI1基因、GhEG基因和GhSCF基因在陆地棉抗黄萎病的过程中起重要作用。成功构建了中植棉KV1接菌前后的均一化全长cDNA文库，库容量为7.5×10~5pfu/mL，重组率为96%。随机挑选了1000个克隆进行测序，得到平均长度为917.75bp的921条高质量EST序列，包括831个unigenes和90条重复序列。利用COG、KOG、KEGG和GO进行功能注释和代谢途径聚类分析，结果显示，169个基因被注释到24种COG分类中，352个基因被注释到24种KOG分类中，343个酶类映射到194个pathway。共获得6783个GO功能注释，平均每个基因有8.16个GO注释。其中3273个注释为生物过程，主要集中于细胞过程和代谢过程；2131个注释为细胞组分，主要集中于细胞和细胞部分；1379个注释为分子功能，主要集中于催化活性和蛋白结合。其中钙调蛋白基因、钙依赖性蛋白激酶基因、钙离子结合蛋白基因、延伸因子Tu基因、WRKY33基因、RIN4基因、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶PBS1基因、转录因子MYC2基因、茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白基因参与陆地棉与大丽轮枝菌互作途径。全长文库的成功构建为下一步克隆基因奠定了基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章绪论  11-24
  1.1 引言  11
  1.2 棉花黄萎病  11-18
    1.2.1 棉花黄萎病的发生与危害  11
    1.2.2 棉花黄萎病的症状  11-12
    1.2.3 棉花黄萎病的病原菌  12-13
    1.2.4 棉花黄萎病的致病机理  13-14
    1.2.5 棉花抗黄萎病机制  14-18
  1.3 植物基因功能研究  18-22
    1.3.1 基因差异表达研究  18-20
    1.3.2 基因功能研究-病毒诱导的基因沉默技术  20-22
  1.4 本研究的目的与意义  22-24
第二章陆地棉高抗黄萎病新品系中植棉 KV1 抗病相关基因表达谱分析  24-46
  2.1 材料和方法  24-34
    2.1.1 材料  24-25
    2.1.2 实验方法  25-34
  2.2 结果与分析  34-43
    2.2.1 陆地棉抗病新品系鉴定与评价  34
    2.2.2 棉株幼根总 RNA 提取及 mRNA 纯化  34-36
    2.2.3 正、反向抑制差减杂交文库构建  36-37
    2.2.4 文库插入片段检测  37
    2.2.5 反向 Northern 杂交筛选正、反向 SSH 文库差异表达基因  37-38
    2.2.6 SSH 文库筛选出陆地棉抗黄萎病特异性基因的功能分类  38-41
    2.2.7 抗病相关基因荧光定量分析  41-43
  2.3 讨论  43-46
第三章利用 VIGS 技术研究棉花抗黄萎病相关基因功能  46-58
  3.1 材料和方法  46-51
    3.1.1 材料  46-47
    3.1.2 方法  47-51
  3.2 结果与分析  51-56
    3.2.1 沉默载体在中植棉 KV1 中高效沉默目的基因  51-52
    3.2.2 目的基因沉默的棉花植株黄萎病抗性鉴定  52-56
  3.3 讨论  56-58
第四章中植棉 KV1 均一化全长 cDNA 文库构建及生物信息学分析  58-76
  4.1 材料和方法  58-65
    4.1.1 材料  58
    4.1.2 实验方法  58-65
  4.2 结果与分析  65-75
    4.2.1 棉株总 RNA 提取及 mRNA 纯化  65
    4.2.2 cDNA 合成  65-66
    4.2.3 均一化  66-67
    4.2.4 均一化文库检测  67-68
    4.2.5 cDNA 文库生物信息学分析  68-75
  4.3 讨论  75-76
第五章全文结论  76-78
参考文献  78-95
致谢  95-96
作者简历  96-97

陆地棉抗黄萎病相关基因筛选及功能验证

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