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陆地棉耐盐相关基因GhVP与GhSAMS的克隆、分析与表达

作 者: 宋丽艳
导 师: 叶武威
学 校: 中国农业科学院
专 业: 作物种质资源学
关键词: 陆地棉 盐胁迫 RACE GhVP GhSAMS Real-time PCR 原核表达
分类号: S562
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


盐胁迫是自然界主要的非生物胁迫之一。土壤中高浓度的盐离子影响着植物的生长和发育,导致作物大量减产。棉花是较耐盐的作物,盐胁迫下,棉花能够通过自身的调节机制来适应胁迫环境。目前,生产上缺乏有效利用的耐盐品种,因此,挖掘棉花耐盐相关基因,创新棉花种质,为棉花耐盐育种提供材料基础就显得至关重要。本研究选用陆地棉耐盐材料中9835,利用RACE结合RT-PCR技术克隆到H~+-焦磷酸酶基因和S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,分别命名为GhVP和GhSAMS,并对这两个基因进行序列特征和生物信息学分析;同时,在0.4%的盐量胁迫法处理下,进行了Real-time PCR分析;并构建了原核表达载体,实现了SAMS基因在大肠杆菌中的表达。主要取得的研究进展如下:1基因克隆与序列特征分析利用RACE结合RT-PCR技术获得GhVP和GhSAMS基因全长序列,其中GhVP基因cDNA全长2678bp,包括5′-UTR 105bp,完整开放阅读框2301bp和3′-UTR 272bp,编码766个氨基酸的多肽。GhSAMS基因cDNA全长1576bp,包括5′-UTR 117bp,完整开放阅读框1182bp,3′-UTR 250bp,PolyA27bp,编码393个氨基酸的多肽。2生物信息学分析生物信息学分析表明,GhVP蛋白与拟南芥、烟草中该蛋白的相似性分别为90%和93%;跨膜预测显示GhVP蛋白含有14个跨膜域,是一个跨膜蛋白;疏水性分析表明GhVP蛋白疏水性较强;进化树分析显示GhVP蛋白与盐生植物盐爪爪、灰绿藜的亲缘关系最近。GhSAMS蛋白与拟南芥、盐地碱蓬、水稻中该蛋白同源性分别为91%、93%、93%;进化树分析显示GhSAMS蛋白与盐地碱蓬的亲缘关系最近;二级结构预测表明,该蛋白是由α-螺旋、β-折叠、转角和无规则卷曲组成;同时,GhSAMS蛋白含有三个保守的功能域。3 Real-time PCR分析选取耐盐材料和盐敏感材料在不同盐处理时期的根系,提取RNA,进行Real-time PCR分析。结果表明,盐胁迫下,GhVP和GhSAMS基因在耐盐材料中受到诱导表达,而在盐敏感材料中盐诱导被推迟,推测这两个基因很可能在陆地棉适应盐胁迫过程中发挥重要作用。4原核表达分析成功构建了原核表达载体pET28a-GhVP和pET28a-GhSAMS,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株进行融合蛋白的诱导表达。GhVP基因在大肠杆菌中没有得到有效表达,改变诱导温度和浓度都没有检测到融合蛋白pET28a-GhVP,初步认为陆地棉GhVP蛋白对大肠杆菌有毒害作用。GhSAMS基因在大肠杆菌中得到了有效表达,检测到了46.6KD的融合蛋白。盐胁迫下,H~+-PPase通过水解底物PPi为Na~+/H~+逆向转运蛋白提供驱动力,促进Na~+在细胞内的分布,以消除Na~+的毒害;S-腺苷甲硫氨酸能够增加细胞间水分运输,减少根系对离子的吸收,从而整体上提高棉花对盐胁迫的适应性。随着逆境分子细胞生物学的发展,这两个基因的分子功能将得到进一步阐述,其有望成为棉花耐盐种质创新的重要来源。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章 绪论  12-24
  1.1 植物耐盐机理  12-16
    1.1.1 植物植株水平上对盐胁迫的适应性  12-13
    1.1.2 植物分子水平对盐胁迫的适应性  13-16
  1.2 棉花的耐盐性  16-17
    1.2.1 棉花的耐盐特性  16
    1.2.2 棉花的耐盐机理  16-17
  1.3 棉花耐盐相关基因研究进展  17-21
    1.3.1 棉花耐盐相关基因的筛选方法  17-18
    1.3.2 棉花上已克隆的耐盐相关基因  18-19
    1.3.3 H~+-PPase 和SAMS 的研究进展  19-21
    1.3.4 棉花耐盐相关基因的转化  21
  1.4 研究目的及意义  21-22
  1.5 实验技术路线  22-24
    1.5.1 文库分析与耐盐相关基因筛选  22-23
    1.5.2 实验流程图  23-24
第二章 陆地棉GhVP 和GhSAMS 基因的克隆与分析  24-47
  2.1 实验材料  24
    2.1.1 供试材料  24
    2.1.2 菌株与质粒载体  24
    2.1.3 酶、生化试剂与试剂盒  24
  2.2 实验方法  24-34
    2.2.1 实验材料处理  24
    2.2.2 根系RNA 的提取  24-25
    2.2.3 目的基因的分离  25-32
    2.2.4 生物信息学分析  32
    2.2.5 盐胁迫下GhVP 和GhSAMS 基因的表达分析  32-34
  2.3 结果与分析  34-46
    2.3.1 RNA 的提取  34
    2.3.2 GhVP 和GhSAMS 基因的获得  34-36
    2.3.3 GhVP 和GhSAMS 基因的生物信息学分析  36-44
    2.3.4 盐胁迫下GhVP 和GhSAMS 基因在陆地棉中的表达模式  44-46
  2.4 讨论  46-47
    2.4.1 H~+-焦磷酸酶基因和S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的分析  46
    2.4.2 H~+-焦磷酸酶基因和S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因表达分析  46-47
第三章 陆地棉GhVP 和GhSAMS 基因在E.coli 中的表达  47-53
  3.1 实验材料  47
    3.1.1 菌株与质粒  47
    3.1.2 酶、生化试剂与试剂盒  47
  3.2 实验方法  47-50
    3.2.1 原核表达载体的构建  47-49
    3.2.2 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE 电泳  49-50
  3.3 结果与分析  50-51
    3.3.1 重组表达质粒的构建与鉴定  50-51
    3.3.2 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE 电泳检测  51
  3.4 讨论  51-53
    3.4.1 重组表达载体的构建策略  51-52
    3.4.2 陆地棉GhVP 在大肠杆菌中的无效表达分析  52-53
第四章 创新点  53-54
第五章 结论  54-55
参考文献  55-61
附录  61-63
致谢  63-64
作者简历  64

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 >
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