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木尔坦棉花曲叶病毒的分子鉴定与致病性研究

作　者: 胡高洁
导　师: 周雪平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 双生病毒棉花曲叶病毒 DNAβ 侵染性克隆病毒诱导的基因沉默
分类号: S435.621
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

双生病毒是植物病毒中唯一的一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒(single stranded DNA,ssDNA)。双生病毒科病毒可侵染双子叶和单子叶植物,在多种重要经济作物上造成严重的减产,我国番茄、烟草、南瓜、胜红蓟和赛葵等作物上也相继发现了多种双生病毒。本论文对广东地区表现为曲叶症状的扶桑上的双生病毒分离物GD37进行了基因组结构研究。对其病毒全长基因组序列测定分析表明,该序列与木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)G6、Nanning和Okra06的序列的同源性达到99%以上。利用DNAβ的特异性引物,从GD37中扩增到卫星DNAβ分子。序列分析表明,该DNAβ全长1347 nts,全序列与CLCuMVNanning、G6和Okra06的DNAβ同源性高达99%。GD37全长序列和DNAβ全长序列分析表明,该病毒分离物为CLCuMV。为了研究CLCuMV和CLCuMV DNAβ在致病中的作用,我们构建了CLCuMV GD37和CLCuMV GD37 DNAβ的侵染性克隆。侵染性测定表明CLCuMV GD37单独可以侵染本氏烟、普通烟、三生烟和心叶烟,但不能产生任何症状或症状轻微,只有与CLCuMV GD37 DNAβ共同侵染时才能诱导产生叶片卷曲、矮化的病害典型症状。Southern印迹检测表明,CLCuMV GD37 DNAβ依赖于辅助病毒进行复制,而DNAβ可以增强病毒在植物中的积累水平,使被病毒侵染的植株显现典型症状。为探索利用CLCuMV在植物上建立高效沉默体系的可行性,我们将CLCuMV和异源卫星分子TYLCCNV DNAβ侵染本氏烟,病株出现明显的曲叶、矮化、耳突,虽然侵染效率较低,但说明CLCuMV能支持异源卫星分子TYLCCNV DNAβ的复制。利用CLCuMV和异源TbCSV DNA 1沉默载体侵染性克隆2mDNA1-NbSu351共同侵染本氏烟,感病植株出现系统叶叶脉和主干白化,呈现明显的Su沉默表型,说明CLCuMV能支持异源TbCSV DNA 1沉默载体侵染性克隆的复制,并能引起植物内源基因的高效沉默。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-9
目录  9-11
第一章文献综述  11-39
  第一部分双生病毒的致病机制与研究进展  11-32
    1.双生病毒的发现及危害  11-13
    2.双生病毒的基因组结构及分类  13-20
      2.1 玉米线条病毒属(Mastrevirus)  14
      2.2 甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)  14-15
      2.3 番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)  15
      2.4 菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)  15-20
    3.与begomoviruses伴随的卫星DNA  20-26
      3.1 DNA 1分子及特征  21-23
      3.2 DNA β分子及特征  23-24
      3.3 其他小分子DNA  24-25
      3.4 双生病毒与小分子DNA形成病害复合体  25-26
    4.双生病毒的侵染  26-32
      4.1 双生病毒的复制  26-28
      4.2 双生病毒的转录  28-29
      4.3 双生病毒的移动  29-32
  第二部分棉花曲叶病毒病的研究进展  32-39
    1.棉花曲叶病毒的危害和分布  32-33
    2.CLCuD的病原学研究  33-37
      2.1 引起CLCuD的毒源  34-35
      2.2 与CLCuV相伴随的卫星DNA  35-36
      2.3 CLCuD病害复合体  36-37
      2.4 CLCuD的流行与防治意义  37
    3.本研究的目的和意义  37-39
第二章材料与方法  39-48
  1.实验材料  39
    1.1 毒源  39
    1.2 植物材料  39
    1.3 菌株和质粒  39
    1.4 试剂  39
  2.实验方法  39-48
    2.1 大量抽提植物总DNA(CTAB法)  39-40
    2.2 PCR技术  40-41
    2.3 琼脂糖凝胶电泳  41
    2.4 PCR产物纯化  41
    2.5 DNA分子的克隆  41-43
    2.6 重组质粒的提取和鉴定  43-44
    2.7 核苷酸序列测定与分析  44
    2.8 侵染性克隆的转化  44-45
    2.9 农杆菌接种  45
    2.10 Southern blot分析  45-48
第三章 CLCuMV广东分离物和CLCuMV DNA β  48-63
  1.材料和方法  48
  2.全长基因组的获得和序列测定  48-53
    2.1 DNA-A全长基因组的获得和序列测定  48-49
    2.2 DNA β全长基因组的获得和序列测定  49-50
    2.3 序列分析  50-52
    2.4 侵染性克隆的构建  52-53
  3.结果和分析  53-60
    3.1 GD37病毒基因组的结构特征  53-56
    3.2 GD37 DNA β的结构特征  56
    3.3 CLCuMV GD37和CLCuMV GD37 DNA β致病性测定  56-59
    3.4 CLCuMV GD37和CLCuMV GD37 DNA β的分子鉴定——Southern blot分析  59-60
  4.讨论  60-63
第四章利用CLCuMV GD37建立病毒诱导的基因沉默体系的初步研究  63-67
  1.实验材料  63-64
  2.实验方法  64
  3.结果分析  64-66
    3.1 CLCuMV GD37能支持异源卫星分子TYLCCNV DNA β的复制  64-65
    3.2 CLCuMV GD37能支持异源TbCSV 2mDNA1-NbSu351沉默载体侵染性克隆的复制,并引起基因沉默  65-66
  4.讨论  66-67
全文小结  67-68
参考文献  68-72
附录A:本论文所用病毒缩写及中英文对照  72-73
附录B:常用缩略语表  73-74
附录C:常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  74-75
附录D:主要试剂的配制  75-80
作者简历及发表论文  80

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