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陆地棉棉铃离层赤霉素、乙烯处理相关基因差减文库的构建

作　者: 张书芹
导　师: 张献龙
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 陆地棉赤霉素乙烯离层抑制差减杂交
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

棉花是世界上的重要经济作物,棉纤维是纺织工业中天然纤维的主要来源,棉花还是重要的战略物质。随着纺织工业的迅猛发展,棉花的需求量逐年递增。目前,棉花的品种改良在很大的程度上改善了棉花的产量和品质,但是棉花蕾铃脱落的现象很普遍。研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,从分子水平研究蕾铃脱落的机制,克隆在离层特异表达的基因,不仅可以深入认识棉花蕾铃脱落的分子机理,还可以为改良棉花产量的遗传工程奠定物质基础。为研究棉铃脱落的机制,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,通过构建抑制差减杂交（SSH）文库的方法,筛选出在离层表达的基因。取得的主要研究结果如下:1.采用赤霉素（gibberellin,GA₃）和乙烯利（ethephon,CEPA）2种激素,分别设置3种浓度（GA₃:10ppm、50ppm、100ppm;CEPA:10ppm、250ppm、1000ppm）处理,在TM-1开花当天点涂棉铃铃柄,7天后调查脱落率。赤霉素处理,在2006年,10ppm和50ppm与对照差异均显著,而100ppm处理与对照无显著差异:2007年,3种处理与对照差异均显著。乙烯利处理,在2006年,250ppm和1000ppm与对照差异均显著,而10ppm处理与对照无显著差异;2007年,3种处理与对照差异均显著。赤霉素各浓度处理效果在年份间差异很大,说明气候条件对赤霉素的作用有很大影响。2.50ppm赤霉素处理有显著的保铃效果,250ppm乙烯利处理能显著促进棉铃的脱落。我们以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,构建了两个离层组织的抑制差减杂交（SSH）cDNA文库。来自于50ppm赤霉素和250ppm乙烯利处理开花当天的棉铃离层cDNA分别作为两个SSH文库的Tester,涂水对照开花当天的棉铃离层cDNA作为两个文库的Driver。反向Norethern杂交在两个文库中筛选克隆,测序了80个克隆,序列分析共产生28条单一序列。在分析的EST中,已知功能的序列包括翻译相关、信号转导、代谢相关、转录相关、能量代谢、蛋白合成和抗逆相关基因,其中有29%是与翻译相关的核糖体基因,这说明了在激素处理后,离层有大量的蛋白质合成。另外,与信号转导和代谢相关的基因占14%,与转录相关的基因占11%。3.为了分析离层优势表达基因的时空表达模式,我们从文库中挑选了10个基因进行了RT-PCR分析。查尔酮合酶基因（Chalcone synthase,CHS）在每个组织不同时期均有表达,但表达量有差异,在赤霉素处理2h后的离层中表达较高。缩氨酸异构酶基因（Cytosolic cyclophilin,ROC3）在根、茎中表达很强,在叶、离层各时期表达较弱,在赤霉素处理2h后的离层中不表达。肿瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein,TCTP）在根、茎中表达很强,在叶中几乎不表达,在赤霉素处理0.5h后微弱表达,12h后表达达到最强。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩写词表  11-12
1 文献综述  12-25
  1.1 前言  12
  1.2 蕾铃脱落的生物学规律  12-13
  1.3 离层的形成  13-14
  1.4 蕾铃脱落的生理原因  14-15
    1.4.1 影响蕾铃脱落的环境因素  14
    1.4.2 有机养料与蕾铃脱落的关系  14-15
  1.5 受精作用与幼铃脱落的关系  15-16
    1.5.1 环境对受精作用的影响  15-16
    1.5.2 受精作用对于叶片同化产物运输分配的影响  16
  1.6 激素与蕾铃脱落的关系  16-19
    1.6.1 生长素  16-17
    1.6.2 乙烯  17
    1.6.3 赤霉素  17-18
    1.6.4 脱落酸  18
    1.6.5 逆境对激素平衡的影响  18-19
    1.6.6 衰老因素  19
    1.6.7 其他物质  19
  1.7 病虫危害对蕾铃脱落的影响  19-20
  1.8 机械损伤对蕾铃脱落的影响  20
  1.9 分离植物差异表达的方法  20-23
    1.9.1 差异显示PCR  20-21
    1.9.2 cDNA代表性差异分析  21
    1.9.3 cDNA-AFLP  21-22
    1.9.4 抑制差减杂交  22
    1.9.5 基因表达系列分析  22-23
    1.9.6 基因芯片  23
  1.10 本课题的研究意义和目的  23-25
2 材料与方法  25-39
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 植物材料  25
    2.1.2 菌株和载体  25
    2.1.3 主要试剂  25
    2.1.4 缓冲液和培养基配方  25-26
  2.2 处理与取材  26
  2.3 组织学切片  26
  2.4 提取总RNA和分离mRNA  26-28
    2.4.1 提取总RNA  26-27
    2.4.2 分离mRNA  27-28
  2.5 SSH差减文库的构建  28-34
    2.5.1 cDNA第一链合成  28
    2.5.2 cDNA第二链合成  28-29
    2.5.3 RsaI酶切  29
    2.5.4 接头连接  29-31
    2.5.5 第一次杂交  31
    2.5.6 第二次杂交  31-32
    2.5.7 第一次PCR扩增  32
    2.5.8 第二次PCR扩增  32-33
    2.5.9 差减片段与载体的连接  33
    2.5.10 连接产物转化  33-34
    2.5.11 差减文库插入片断长度检测  34
  2.6 差减基因片段的反向Northern杂交筛选  34-36
    2.6.1 点膜  34-35
    2.6.2 探针标记  35
    2.6.3 反向Northern杂交筛选  35-36
  2.7 差异表达克隆的挑取及测序  36
  2.8 序列同源性检索  36
  2.9 差异表达基因的RT-PCR分析  36-39
    2.9.1 DNase处理  36-37
    2.9.2 RNA定量  37
    2.9.3 cDNA逆转录  37
    2.9.4 PCR  37-39
3 结果和分析  39-51
  3.1 赤霉素,乙烯对棉铃脱落的影响  39-41
  3.2 离层细胞的组织学分析  41
  3.3 总RNA含量和质量的检测  41-42
  3.4 mRNA的质量检测  42-43
  3.5 SSH文库的构建  43-44
  3.6 文库装载和克隆挑选  44-45
  3.7 文库初步筛选  45
    3.7.1 PCR扩增筛选  45
    3.7.2 反向Northern筛选  45
  3.8 测序结果及其同源性分析  45-49
    3.8.1 同源性检索  45-47
    3.8.2 已测序EST序列分类  47-49
  3.9 RT-PCR分析结果  49-51
4 讨论  51-54
  4.1 关于脱落率的调查  51
  4.2 关于抑制差减杂交的田间取材  51
  4.3 离层总RNA的提取  51-52
  4.4 差减文库的构建  52
  4.5 离层差异表达基因的探讨  52-54
参考文献  54-61
致谢  61

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