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C2C12细胞中FHL3对不同肌纤维类型MyHC基因表达的影响

作　者: 李媛
导　师: 左波
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 肌纤维类型 小干扰RNA C2C12细胞 FHL3
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


肌纤维类型在决定肌肉生长和肉质方面起着重要作用,不同纤维类型肌球蛋白重链(MyHC)基因,如MyHC slow.MyHC 2a.MyHC 2x和MyHC 2b,是目前公认的区分不同肌肉纤维类型的分子标记,因此发现调控不同肌纤维类型MyHC基因表达的基因及其分子机制,对提高瘦肉产量和品质具有重要意义。FHL3蛋白属于LIM超家族,可通过与MyoD.CREB等重要蛋白相互作用参与调节肌细胞分化、细胞骨架形成以及下游基因表达。但有关FHL3是否调控MyHC基因表达尚不清楚。本研究以小鼠C2C12成肌细胞为模型,研究干涉FHL3基因后不同纤维类型MyHCmRNA水平上的表达变化。具体结果如下：1、通过荧光实时定量PCR和Western Blotting技术研究了FHL3基因和MyHCl、2a、2x和2b基因在细胞分化0h、48h、96h和144h的变化情况：在成肌细胞向肌管分化过程中,FHL3基因表达量逐渐减少,而MyHC slow基因在肌管形成初期表达量急剧增加,肌管完全形成后又有所下降；MyHC 2a基因随着细胞的分化表达量逐步增加,在肌管形成后表达量最高；MyHC 2b和MyHC 2x基因也是随着细胞的分化表达量增加,但分化前期变化较小,到肌管基本形成时期表达量陡增。2、利用siRNA小片段进行干扰试验,筛选出其中的siRNAs#3对FHL3的干涉效果较好。并用siRNA #3转染C2C12细胞,转染24h后分化24h、48h、72h,结果分化24h和48h细胞的FHL3相对表达量显著降低。3、利用siRNA #3转染C2C12细胞,转染24h后分化72h,结果显示MyHC slow和MyHC 2a的表达量显著降低,MyHC 2x的表达却显著升高而MyHC 2b的表达无显著性变化。而用siRNA #3转染C2C12细胞,转染48h后分化48h,结果MyHC show表达量显著降低,MyHC 2b和MyHC 2x的表达量显著增加,而MyHC 2a表达降低不明显。比较以上结果发现,其中MyHC slow和MyHC 2x在两种处理的表达变化较一致。4、利用siRNA#3转染分别分化24h、48h和72h的C2C12细胞,转染后继续分化48h,结果分化24h和48h细胞的FHL3的表达量分别显著和极显著降低,对应的MyHC slow和MyHC 2a的表达量也均显著和极显著降低。与以上结果比较发现,MyHC slow的表达量均随FHL3表达的降低而降低。本试验结果显示在C2C12细胞中降低FHL3对MyHC基因有显著的影响,FHL3对MyHC 2b和MyHC 2x有负调节作用,对MyHC slow和MyHC 2a有正调节作用。本研究为进一步阐述FHL3如何调节MyHC基因的表达提供了重要的线索,其作用机理还有待进一步研究。

全文目录


摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
第一章 前言  12-25
  1 骨骼肌肌纤维的类型及其特征,肌纤维与肉质的关系  12-14
    1.1 骨骼肌肌纤维的类型及其特征  12-14
    1.2 不同肌纤维类型与肉质的关系  14
  2 肌纤维类型转化信号通路相关研究进展  14-19
    2.1 胰岛素样生长因子(IGFs)通路  14-16
    2.2 CaN-NFAT信号通路  16-18
    2.3 肌肉发生调控因子(myogenic regulatory factors,MRFs)调控途径  18-19
  3 FHL3家族的研究进展  19-23
    3.1 LIM蛋白的特征、分类及其功能  19-21
    3.2 FHL家族成员及特点  21-22
    3.3 FHL3的结构特点和功能  22-23
  4 RNA干涉技术  23-25
第二章 研究目的和意义  25-26
第三章 材料与方法  26-41
  1 试验材料  26-29
    1.1 试验样品  26
    1.2 主要仪器设备  26-27
    1.3 主要试剂和试剂盒  27-28
    1.4 常用试剂及其配制  28-29
  2 试验方法  29-41
    2.1 细胞培养  29-31
    2.2 FHL3 siRNA表达载体的构建  31-32
      2.2.1 FHL3 siRNAs的设计和合成  31
      2.2.2 FHL3 RNAi表达载体的构建  31-32
      2.2.3 FHL3 RNAi表达载体的鉴定和提取  32
      2.2.4 超纯质粒的提取  32
    2.3 化学合成FHL3-siRNA小片段的设计  32-33
    2.4 脂质体介导的细胞转染(6孔板)  33
    2.5 细胞RNA的提取和cDNA的制备  33-35
      2.5.1 细胞RNA的提取  33-34
      2.5.2 RNA的检测  34
      2.5.3 反转录反应  34-35
    2.6 FHL3及MyHC各亚型基因的表达分析  35-38
      2.6.1 Real-time PCR的引物设计  35-37
      2.6.2 荧光实时定量PCR  37-38
      2.6.3 定量数据分析  38
    2.7 western blot分析  38-41
      2.7.1 蛋白的提取  38-39
      2.7.2 SDS-PAGE电泳  39
      2.7.3 转膜  39-40
      2.7.4 免疫反应  40
      2.7.5 ECL化学发光检测  40-41
第四章 结果与分析  41-52
  1 C2C12细胞分化  41
  2 小鼠C2C12细胞总RNA的提取和反转录  41-42
  3 分化不同时期的细胞  42-45
    3.1 目的基因FHL3、MyoD和MyHC各亚型基因在细胞分化不同时期的相对表达量  42-44
    3.2 目的蛋白FHL3在细胞分化不同时期的表达变化  44-45
  4 FHL3基因的干扰分析  45-52
    4.1 FHL3 siRNA表达载体的酶切鉴定  45-46
    4.2 FHL3 siRNA表达载体的转染效果  46
    4.3 荧光标记的化学合成FHL3-siRNA小片段的转染效果  46-47
    4.4 小干扰RNA片段对目的基因FHL3的影响  47
    4.5 siRNA#3转染48h后分化不同时间段细胞FHL3 mRNA水平的变化  47-48
    4.6 siRNA#3转染48h后分化不同时间段细胞FHL3蛋白水平的变化  48-49
    4.7 siRNAs#3转染后分化细胞的MyHC各亚型基因mRNA水平的变化  49-50
    4.8 分化不同时间段后转染siRNA#3细胞的FHL3和MyHC基因的变化  50-52
第五章 讨论  52-56
  1 RNA干涉的效率  52-53
    1.1 siRNA片段设计技巧  52
    1.2 如何提高siRNAs的转染效率  52-53
  2 FHL3在C2C12细胞分化过程中表达量的变化及其与对MYHC基因表达的影响  53-54
  3 本实验在转染时间上的选择  54-55
  4 下一步工作  55-56
小结  56-57
参考文献  57-65
致谢  65

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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