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携载基质金属蛋白酶小干扰RNA壳聚糖纳米微球防止体外培养的软骨细胞退变的研究

作　者: 赵晶鑫
导　师: 张春礼；范宏斌
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 软骨细胞小干扰RNA 纳米微球基质金属蛋白酶
分类号: R318
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:软骨组织工程中,体外扩增的软骨细胞极易发生去分化,表现为细胞表型消失,合成细胞外基质能力下降。基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinase, MMP)是一组广泛存在于各种组织、可降解细胞外基质的蛋白酶,与软骨细胞去分化、软骨退变关系密切。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指将与靶基因同源序列的双链RNA导入细胞,在细胞内与靶基因的信使RNA(messenger RNA, mRNA)结合并迅速将其降解,从而抑制该基因表达。壳聚糖(chitosan, CS)是一种带正电荷的大分子,在一定条件下可与带负电荷的核酸结合,形成纳米级别的聚合物可被细胞胞吞。本研究拟使用携载MMP-3和13的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)质粒的壳聚糖纳米微粒转染体外培养的种子细胞,试图抑制去分化相关基因表达,培养出表型优良、稳定的软骨细胞,防止再生软骨细胞退变。实验一软骨细胞的体外培养与鉴定目的:通过体外培养兔关节软骨细胞,观察软骨细胞的形态、体外培养时维持细胞表型的能力,选出最适合作软骨组织工程的种子细胞。方法:利用贯序酶消化法分离兔关节软骨,体外培养,并利用组织学和免疫细胞化学等方法鉴定、评价软骨细胞功能。结果:利用胰酶-胶原酶贯序消化法,可成功消化兔关节软骨细胞,并成功培养。用HE、甲苯胺蓝、番红-O等组织学染色方法予以鉴定,Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫细胞化学法观察软骨细胞功能。结论:通过体外培养,原代至第3代的软骨细胞维持表型的能力无明显差异,适合做组织工程的种子细胞,第4代以后发生去分化、分泌Ⅱ型胶原的能力显著减低。实验二携载质粒的纳米微球转染体外培养的兔关节软骨细胞目的:研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力,镜下观察其大小和形态,观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法:用分子量在5K到800K之间的六种壳聚糖,利用表达增强型绿色荧光蛋白质粒(plasmid Enhanced Green Florescence Protein, pEGFP)作报告基因,通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况;并计算转染效率。结果:分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球,其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当。结论:与脂质体转染组相比,氮/磷(Nitrogen /Phosphate, N/P)比值为5时,相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞,可作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。实验三携载MMP3、13-shRNA的壳聚糖纳米微球转染体外培养的兔关节软骨细胞目的:通过利用携载MMP3、13-shRNA的壳聚糖纳米微球体外转染原代兔关节软骨细胞,利用实时定量聚合酶链式反应(real -time quantitative Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)检测基因干扰效果,并与阴性对照组比较。方法:利用分子量800K的壳聚糖制作携载MMP3、13的shRNA的壳聚糖纳米微球,N/P比值为5,体外转染原代培养的兔关节软骨细胞,设立随即核酸序列作为阴性对照。利用qRT-PCR检测干扰效率。结果:携载MMP-3和13基因的siRNA质粒的壳聚糖纳米微球能成功转染兔关节软骨细胞,其干扰MMP表达的效率均可达20%左右,并显著高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:携载MMP的siRNA质粒的壳聚糖纳米微球能成功转染,并有效干扰MMP-3和13表达mRNA,可用于进一步体内试验。

全文目录

缩略语表  7-11
中文摘要  11-14
英文摘要  14-18
前言  18-20
文献回顾  20-37
  引言  20
  1 软骨组织与软骨组织工程  20-23
  2 软骨细胞退变与 MMP 之间的关系  23-28
  3 RNAi 技术及其在基因治疗中的应用  28-33
  4 壳聚糖纳米微球作为转染载体转染软骨细胞的相关研究  33-36
  5 携载 MMP的siRNA质粒的纳米微球转染软骨细胞的展望  36-37
实验一软骨细胞的体外培养与鉴定  37-43
  1 材料  37
    1.1 实验动物  37
    1.2 主要试剂  37
    1.3 主要仪器及材料  37
  2 方法  37-39
    2.1 兔关节软骨细胞体外分离和培养  37-38
    2.2 单层体外培养的兔关节软骨细胞组织学观察  38-39
  3 结果  39-42
    3.1 大体观察  39-40
    3.2 HE 染色  40
    3.3 甲苯胺蓝染色  40
    3.4 免疫组织化学检测  40-41
    3.5 番红-O 染色  41-42
  4 讨论  42-43
实验二壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究  43-62
  1 材料  43-44
    1.1 主要试剂  43
    1.2 主要仪器及材料  43-44
  2 方法  44-50
    2.1 感受态的制备和质粒的转化、鉴定  44-46
    2.2 利用复合凝聚法制备壳聚糖-pDNA 纳米微球  46-47
    2.3 凝胶电泳阻滞实验  47
    2.4 壳聚糖-pDNA 纳米微球粒径和包裹率的检测  47-48
    2.5 微球形态的观察  48
    2.6 体外转染实验  48-49
    2.7 转染效果和效率的观察  49
    2.8 壳聚糖-pDNA 纳米微球的细胞毒性实验  49
    2.9 统计学分析  49-50
  3 结果  50-58
    3.1 壳聚糖-pDNA 纳米微球的形成及其理化性质  50-53
    3.2 CS-pDNA 纳米微球的形态的观察  53-55
    3.3 壳聚糖-pDNA 纳米微球转染原代兔关节软骨细胞  55-57
    3.4 壳聚糖-pDNA 纳米微球对原代兔关节软骨细胞增殖的影响  57-58
  4 讨论  58-62
实验三携载MMP 的siRNA 的壳聚糖纳米微球转染体外培养的兔关节软骨细胞  62-67
  1 材料  62
    1.1 实验动物  62
    1.2 主要试剂和设备  62
  2 方法  62-64
    2.1 兔关节软骨细胞的体外培养  62
    2.2 携载MMP-siRNA 的shRNA 质粒载体的构建  62-63
    2.3 壳聚糖纳米微球转染体外培养的兔关节软骨细胞  63
    2.4 实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测基因干扰效率  63-64
  3 结果  64-66
    3.1 对MMP3 干扰效率  64-65
    3.2 对MMP13 的干扰效率  65-66
  4 讨论  66-67
小结  67-69
参考文献  69-77
附录  77-78
个人简历和研究成果  78-79
致谢  79-80

携载基质金属蛋白酶小干扰RNA壳聚糖纳米微球防止体外培养的软骨细胞退变的研究

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