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凋亡抑制基因c-FLIP的RNA干扰对骨肉瘤细胞株MG-63生物学活性的影响

作　者: 张小平
导　师: 周勇；杨彤涛
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 骨肉瘤 c-FLIP 凋亡增值小干扰RNA
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:骨肉瘤是临床上最为常见的原发性恶性骨肿瘤,多见于儿童和青少年,好发于血运丰富的长骨干骺端,具有恶性程度高、转移发生率早、病情进展迅速且病死率高等特点,常导致临床治疗的失败和患者的死亡[1]。目前有研究认为细胞的增殖与凋亡在肿瘤的发生、发展中发挥着十分重要的作用;凋亡途径的受阻也可使细胞耐受放疗、化疗的刺激。因此,诱导肿瘤细胞凋亡成为了一种新的杀伤肿瘤细胞的治疗策略。细胞型Fas相关死亡域样白介素-1β转换酶抑制蛋白c-FLIP(Cell Fas-associated death domain-like IL-1 beta converting enzyme inhibitory protein, c-FLIP)是一种新发现的凋亡抑制蛋白,属于抗凋亡家族的新成员,特异性的表达于恶性黑色素瘤、Kaposi瘤、大肠癌及非霍奇金淋巴瘤中,具有控制细胞凋亡和分裂的双重作用[2]。由于它所具有的特异性表达以及促进肿瘤生长的功能,使之成为肿瘤治疗的新靶点。目的:检测c-FLIP在骨肉瘤组织中的表达,分析其表达水平与临床病理特征的关系;观察骨肉瘤细胞MG-63中c-FLIP表达下调对该细胞增殖、凋亡活性的影响。方法:1.收集47例临床资料完整石蜡包埋的骨肉瘤肿瘤标本,25例骨软骨瘤标本,8例正常的骨组织标本,用免疫组织化学方法检测c-FLIP蛋白的表达,分析c-FLIP的表达与骨肉瘤分化程度、组织类型、淋巴转移的关系;2.设计制备多对针对c-FLIP基因的小干扰片段,通过脂质体LipofectamineTM 2000转染骨肉瘤细胞株MG-63;荧光显微镜观察转染效率;采用RT-PCR、Western blot分别检测在mRNA和蛋白水平上c-FLIP的表达,筛选出沉默效果最好的siRNA;3.转染沉默效率最高的siRNA,分别采用MTT法、流式细胞仪和TUNEL法检测c-FLIP表达下调的MG-63细胞增殖、凋亡活性的变化。结果:1.c-FLIP在骨肉瘤组的蛋白表达水平高于骨软骨瘤组和正常组(p<0.05),c-FLIP在骨肉瘤组织中的蛋白表达水平与Ennecking分期密切相关(p<0.05)、与肿瘤直径、淋巴结转移和病理分型无关(p>0.05);2.转染针对c-FLIP基因的siRNA-3后,其导致的c-FLIP mRNA和蛋白的表达降低最为显著,沉默效率最高;3.MTT实验显示:转染24h后,干扰组细胞在各时点的光吸收值均低于对照组(P<0.05)。转染48小时后,干扰组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),干扰组处于G1期细胞高于对照组(P<0.05)。TUNEL试验显示,干扰组凋亡细胞数(30%)高于对照组(6%)(P<0.05)。结论:1.c-FLIP在骨肉瘤组织中表达明显升高,并与骨肉瘤患者的Ennecking分期密切相关,与组织类型及淋巴转移无关;2.c-FLIP可降低MG-63细胞的增殖活性,并增加其凋亡活性。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-15
文献回顾  15-34
  一、细胞凋亡  15-21
  二、c-FLIP 的研究进展  21-29
  三、RNA 干扰的研究进展  29-34
实验一 c-FLIP 在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义  34-42
  1 材料  34-35
  2 方法  35-36
  3 结果  36-39
  4 讨论  39-42
实验二 RNAi 对骨肉瘤MG-63 细胞c-FLIP 表达的抑制作用  42-52
  1 材料  42-43
  2 方法  43-48
  3 结果  48-50
  4 讨论  50-52
实验三靶向阻断c-FLIP 表达的siRNA 对骨肉瘤细胞MG-63 生物学活性的影响  52-63
  1 材料  52-53
  2 方法  53-56
  3 结果  56-60
  4 讨论  60-63
小结  63-64
参考文献  64-75
个人简历和研究成果  75-76
致谢  76

凋亡抑制基因c-FLIP的RNA干扰对骨肉瘤细胞株MG-63生物学活性的影响

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