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柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2（EtRON2）基因的克隆表达及功能初步研究

作　者: 戚南山
导　师: 蔡建平；李祥瑞
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2 克隆表达亚细胞定位转录水平
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

棒状体(rhoptry)是存在于顶复门原虫的一种特殊亚细胞器,与微线(microneme)、类锥体(conoid)等一起共同形成其分类上的结构特点——顶端复合体(Apical complex)。对疟原虫、弓形虫等的深入研究表明,在顶复门原虫入侵过程中,通过虫体前端与宿主细胞膜之间形成一个活动的连接区域——运动结合体(Moving Juction, MJ),并介导虫体入侵过程的早期机制,已知微线分泌的顶膜抗原(Apical Membrane Antigen 1, AMA1)及部分棒状体颈部蛋白(RON2、RON4、RON5)是形成MJ复合物的重要成分或功能分子。然而迄今对艾美耳球虫棒状体蛋白和棒状体颈部蛋白尚未进行任何研究。本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接得到柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体颈部蛋白2 (EtRON2)的基因序列,以预测的序列设计特异性引物,以E.tenella子孢子总RNA为模板,用RT-PCR的方法扩增出Etron2全长ORF；并以此全长ORF序列设计特异性引物,以E.tenella子孢子的基因组DNA为模板,用PCR方法成功扩增出Etron2ORF片段的gDNA序列片段。生物信息学分析结果显示,Etron2 ORF片段的gDNA含有11个内含子；ORF全长为4020bp,编码一包括5’端信号肽的全长为1339个氨基酸的多肽片段,与其他物种RON2的氨基酸序列相似性为15%-41%。通过生物信息学方法解析EtRON2的抗原性及其疏水性,以此对Gene Bank和E.tenella基因组数据库进行搜索比对,选择EtRON2特异性的潜在抗原表位。以其序列设计引物,特异性扩增编码抗原表位的序列片段(EtRON2Ag,序列长度为228bp,编码925-1152位点的76个氨基酸),构建pMAL-c2x-EtRON2Ag重组子,于E.coli Rosseta(DE3)中重组表达并免疫小鼠制备特异性抗体,利用激光共聚焦显微镜研究EtRON2在E.tenella子孢子内的免疫荧光亚细胞定位；分别收集感染E.tenella后5、7、10、15、20日鸡的血清,以EtRON2Ag抗原包被ELISA板,检测收集血清中Anti-EtRON2Ag的效价。结果显示,EtRON2定位于E.tenella子孢子的顶端；ELISA法检测感染E.tenella 10天后鸡血清中EtRON2Ag的抗体效价为1:50,初步表明E.tenella在感染鸡体过程中可以分泌表达EtRON2蛋白,并诱导产生抗体。选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA；选择Etactin作为参照基因,Etron2和Etama为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2和Etama转录水平的差异。结果显示,Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子,说明可能在未孢子化阶段基因被储备,以便于入侵时大量分泌；Etama在子孢子阶段转录水平最高,其他阶段都相对很低,说明子孢子阶段该基因的表达蛋白分泌最旺盛；比较Etron2和Etama转录水平发现,子孢子阶段Etama (?)专录水平更高,提示EtAMA蛋白在子孢子入侵宿主细胞时具有更重要或更长时间的作用。选择不同的原核表达载体(pET-32a(+)、pMAL-c2x、pCold-TF和pCold-SUMO),利用不同表达菌(E.coli Rosseta(DE3)、E.coli BL21)重组表达切除信号肽编码片段的Etron2,优化表达策略,结果显示目的片段仅在pET-32a(+)-E.coli Rosseta(DE3)中于16℃条件下表达,以包涵体形式存在。说明温度、载体以及宿主表达菌的选择对蛋白的表达都有一定的影响。

全文目录

摘要 7-9Abstract 9-11前言 11-14 参考文献 13-14第一章文献综述 14-28 一、鸡球虫病概述 14-15 二、顶复门原虫入侵相关因子的研究进展 15-20 1. 顶复门原虫的宿主细胞入侵机制 15 2. 顶复门原虫入侵相关因子 15-20 三、展望 20-21 参考文献 21-28第二章柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(EtRON2)基因的预测与克隆 28-60 1 引言 28 2 材料和方法 28-37 2.1 材料 28-31 2.2 方法 31-37 3 结果与分析 37-56 3.1 子孢子总RNA的提取 37 3.2 Etron2基因全长ORF序列的克隆及序列分析 37-56 4 讨论 56-58 参考文献 58-60第三章 EtRON2在E.tenella子孢子内亚细胞定位的研究 60-78 1 引言 60 2 材料和方法 60-71 2.1 材料 60-63 2.2 方法 63-71 3 结果与分析 71-76 3.1 序列片段(EtRON2Ag)的生物信息学分析 71-72 3.2 pMAL-c2x-EtRON2Ag重组表达质粒的构建 72-73 3.3 pMAL-c2x-EtRON2Ag表达、纯化及免疫印迹分析 73-74 3.4 小鼠及鸡血清效价的测定 74 3.5 E.tenella广东株子孢子分离纯化 74 3.6 EtRON2在E.tenella子孢子内的亚细胞定位 74-76 4 讨论 76-77 参考文献 77-78第四章 EtRON2不同发育阶段转录水平差异的研究 78-88 1 引言 78 2 材料与方法 78-81 2.1 材料 78-79 2.2 方法 79-81 3 结果与分析 81-84 3.1 总RNA电泳图 81-82 3.2 Real time q-PCR 引物的筛选 82 3.3 样品扩增曲线 82-83 3.4 样品熔解曲线 83 3.5 扩增效率 83 3.6 相对转录水平 83-84 4 讨论 84-86 参考文献 86-88第五章 EtRON2的重组表达及Western blot分析 88-102 1 引言 88 2 材料和方法 88-95 2.1 材料 88-90 2.2 方法 90-95 3 结果 95-98 3.1 重组表达质粒的构建 95-97 3.2 重组表达质粒在大肠杆菌中的表达 97-98 4 讨论 98-100 参考文献 100-102全文总结 102-104致谢 104

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