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特异性表面结合肽调控稀土纳米材料自噬和毒性的研究

作　者: 张云娇
导　师: 温龙平
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 自噬 稀土纳米材料 噬菌体展示 多肽 上转换发光 毒性 细胞相互作用 癌症诊断 治疗
分类号: TB383
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


自噬是细胞维持自稳态的关键生物学过程。近年来的研究发现,纳米材料进入细胞内会导致自噬水平异常升高。这一效应已作为一个不容忽视的安全性问题严重限制了纳米材料的开发和应用。本文将描述利用多肽的表面改性方法促进纳米材料在生物医疗中应用的又一成功实例。在本论文中,我们通过噬菌体展示技术筛选到了一种与稀土纳米材料高亲和力特异性结合的短肽RE-1,该短肽能够在纳米晶体表面形成一肽涂层,增强纳米材料的悬浮能力,降低纳米材料与细胞间的相互作用,从而屏蔽纳米材料的自噬活性及由此引发的毒性效应。另一方面,将RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)连在RE-1上组成的双功能复合短肽RE-RGD-1则能够通过与细胞外的整合素(Integrins)相互作用而增强稀土纳米材料与整合素高表达细胞的相互作用,提高其在细胞中的自噬及毒性效应,显示通过靶向策略有望同时实现在正常细胞中屏蔽自噬和在靶细胞中提高自噬的目标。本文第一次研究了采用一系列特异性表面结合肽,人为调控稀土纳米材料的细胞自噬行为,从而大大降低纳米材料的毒副作用并提高对肿瘤靶细胞的杀伤效应。纳米材料的生物安全性问题可以通过对自噬效应的人工调控而得到解决,通过调控纳米材料的自噬水平而达到癌症细胞放化疗效果得以实现。这一成果为稀土纳米材料在体内的诊疗应用提供了新方法新思路。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-7
目录  7-15
第1章 绪论  15-39
  1.1 纳米材料概述  15-17
    1.1.1 什么是纳米材料  15
    1.1.2 纳米材料的特性  15
    1.1.3 稀土纳米材料  15-17
  1.2 纳米材料生物医学应用前景及展望  17-20
    1.2.1 内米材料在生物和医学领域的应用  17-18
    1.2.2 稀土上转换发光纳米材料在生物和医学领域的应用  18-19
    1.2.3 纳米材料的生物安全性评估  19-20
  1.3 自噬是细胞维持自稳态的关键生物学过程  20-24
    1.3.1 什么是细胞自噬  20
    1.3.2 细胞自噬的发展历史  20-22
    1.3.3 细胞自噬的分类  22-23
    1.3.4 细胞自噬的发生与检测  23-24
  1.4 细胞自噬的生理学和病理学意义  24-28
    1.4.1 自噬与癌症  25-26
    1.4.2 自噬与神经退行性疾病  26-27
    1.4.3 自噬与发育  27
    1.4.4 自噬与感染、免疫及炎症反应  27-28
    1.4.5 自噬与代谢  28
    1.4.6 自噬与衰老  28
  1.5 自噬是许多纳米材料都具备的特殊生物学效应  28-32
    1.5.1 纳米材料调控自噬效应的国内外研究现状和发展趋势  28-29
    1.5.2 纳米材料调控细胞自噬为肿瘤的治疗提供了重大机遇  29-31
    1.5.3 纳米材料的自噬效应引发的生物安全性问题  31-32
  1.6 利用多肽修饰的改性方法使纳米材料引发自噬得以有效调控成为可能  32-39
    1.6.1 纳米材料的修饰和表面改性  33-34
    1.6.2 多肽及蛋白质对纳米材料的调控  34
    1.6.3 利用噬菌体展示技术筛选与纳米材料特异性结合的多肽  34-39
第2章 应用噬菌体展示技术成功获得短肽RE-1  39-53
  2.1 引言  39
  2.2 实验材料  39-41
    2.2.1 试剂  39-41
    2.2.2 实验装置及耗材  41
  2.3 仪器和设备  41-42
  2.4 实验方法  42-47
    2.4.1 噬菌体展示技术筛选REOB-1  42-44
    2.4.2 设计合成单克隆噬菌体特异引物  44
    2.4.3 PCR鉴定特异性噬菌体的结合能力  44-45
    2.4.4 RE-1及其类似物的化学合成  45
    2.4.5 UCN(NaYF4：Yb,Er)的合成方法  45
    2.4.6 TEM观察REOB-1噬菌体与UCN的结合  45-46
    2.4.7 多肽类似物与Nd2O3的结合力鉴定  46
    2.4.8 RE-1短肽和REOB-1噬菌体与纳米Nd2O3的竞争结合实验  46-47
    2.4.9 数据分析  47
  2.5 实验结果和讨论  47-52
    2.5.1 噬菌体展示技术筛选特异性结合噬菌体REOB-1  47-48
    2.5.2 PCR鉴定噬菌体REOB-1的结合力  48-49
    2.5.3 TEM观察REOB-1噬菌体与UCN的结合形式  49
    2.5.4 RE-1短肽抑制REOB-1与纳米Nd2O3的结合  49-50
    2.5.5 多肽类似物与纳米Nd203的结合  50-52
  2.6 本章小结  52-53
第3章 RE-1特异性地高亲和力结合稀土纳米材料并形成表面涂层  53-83
  3.1 引言  53
  3.2 实验材料  53-54
    3.2.1 试剂  53-54
    3.2.2 实验装置及耗材  54
  3.3 仪器设备  54-55
  3.4 实验方法  55-63
    3.4.1 稀土上转换发光纳米材料的制备方法  55
    3.4.2 ICP-MS鉴定稀土上转换发光纳米材料的浓度  55-56
    3.4.3 测试RE-1与多种纳米材料的结合能力  56
    3.4.4 RE-1与稀土上转换发光纳米材料结合实验  56
    3.4.5 RE-1与稀土上转换发光纳米材料结合能力的鉴定方法  56-57
    3.4.6 AP-1与RE-1竞争结合UCN稀土上转换发光纳米材料的实验方法  57
    3.4.7 溶液环境对RE-1与稀土上转换发光纳米材料结合能力的影响  57-58
    3.4.8 RE-1与稀土上转换发光纳米材料(UCN、UCP)的解离情况  58-59
    3.4.9 RE-1与稀土上转换发光纳米材料结合分子数计算方法  59-60
    3.4.10 稀土上转换发光纳米材料纳米尺度和电势的鉴定方法  60
    3.4.11 肽肽竞争实验方法  60-61
    3.4.12 TEM观察RE-1与UCN的结合形式  61
    3.4.13 SEM观察RE-1与UCN的结合形式  61-62
    3.4.14 UV-Vis紫外可见吸收光谱法检测RE-1与UCN的结合  62
    3.4.15 ~1H NMR核磁共振法  62
    3.4.16 傅立叶红外转换光谱法(FTIR)  62
    3.4.17 圆二色谱法(CD)  62-63
    3.4.18 表面等离子体共振法(SPR)  63
    3.4.19 等温滴定微量热法(ITC)  63
    3.4.20 数据分析  63
  3.5 实验结果和讨论  63-81
    3.5.1 RE-1仅特异性结合稀土纳米材料  63-64
    3.5.2 确定RE-1与稀土上转换发光纳米材料的结合时间  64-65
    3.5.3 确定RE-1与稀土上转换发光纳米材料的结合浓度  65-66
    3.5.4 DLS和TEM确定稀土上转换发光纳米材料的尺度分布  66-67
    3.5.5 计算RE-1与稀土上转换发光纳米材料的结合分子数  67-68
    3.5.6 对照肽AP-1对RE-1与稀土上转换发光纳米材料的结合影响  68-69
    3.5.7 ζ电势分析  69
    3.5.8 RE-5对UCN粒径和ζ电势的影响  69-71
    3.5.9 肽肽竞争证明RE-1与UCN结合的高亲和力  71
    3.5.10 溶液环境对RE-1与稀土上转换发光纳米材料结合能力的影响  71-73
    3.5.11 UV-VIS证明FITC-RE-1与UCN的相互作用  73-74
    3.5.12 RE-1在UCN表面形成一层紧密的肽包裹层  74-75
    3.5.13 核磁共振法(1H NMR)证明RE-1与UCN的相互作用  75-76
    3.5.14 傅立叶转换红外线光谱(FTIR)证明RE-1与UCN的相互作用  76-77
    3.5.15 圆二色光谱法(CD)证明RE-1与UCN的相互作用  77-78
    3.5.16 等温滴定量热法(ITC)证明RE-1与UCN的相互作用  78-79
    3.5.17 表面等离子共振法(SPR)证明RE-1与UCN的相互作用  79-80
    3.5.18 RE-1与稀土上转换发光纳米材料结合后的解离条件分析  80-81
  3.6 本章小结  81-83
第4章 RE-1提高稀土纳米材料在水中的悬浮能力并减少与细胞及表面的相互作用  83-97
  4.1 引言  83
  4.2 实验材料  83-84
    4.2.1 细胞株  83
    4.2.2 试剂  83-84
    4.2.3 实验装置及耗材  84
  4.3 仪器和设备  84
  4.4 实验方法  84-88
    4.4.1 UCN的上转换荧光光谱检测方法  84-85
    4.4.2 细胞培养  85
    4.4.3 RE-1影响稀土上转换发光纳米材料非特异性粘附能力鉴定方法  85-86
    4.4.4 PEG与UCN的结合方法  86
    4.4.5 时间动力学检测沉降速率的方法  86
    4.4.6 UCP悬浮能力直接观察方法  86-87
    4.4.7 稀土上转换发光纳米材料在溶液中的扩散能力检测方法  87
    4.4.8 数据分析  87-88
  4.5 实验结果和讨论  88-95
    4.5.1 RE-1不影响UCN的上转换荧光  88
    4.5.2 RE-1降低了稀土上转换发光纳米材料的非特异性粘附  88-90
    4.5.3 RE-1降低稀土上转换发光纳米材料的沉降速度  90-92
    4.5.4 RE-1增强稀土上转换发光纳米材料的悬浮能力  92-93
    4.5.5 RE-1降低稀土上转换发光纳米材料的扩散能力  93-95
    4.5.6 RE-1也能减少UCN与盖玻片的非特异性相互作用  95
  4.6 本章小结  95-97
第5章 RE-1有效屏蔽稀土纳米材料的细胞自噬效应,减少其毒性,提高其生物安全性  97-131
  5.1 引言  97
  5.2 实验材料  97-98
    5.2.1 试剂  97-98
    5.2.2 细胞株  98
    5.2.3 实验动物  98
    5.2.4 实验装置及耗材  98
  5.3 仪器和设备  98
  5.4 实验方法  98-105
    5.4.1 细胞培养方法  98-99
    5.4.2 稳定表达GFP-LC3的GFP-LC3/HeLa细胞株的建立  99
    5.4.3 诱导细胞自噬的实验操作方法  99
    5.4.4 GFP-LC3点状聚集阳性细胞统计方法  99
    5.4.5 自噬标记物染色实验方法  99-100
    5.4.6 诱导肝脏组织自噬的方法  100
    5.4.7 Western Blot检测方法  100-103
    5.4.8 透射电子显微镜(TEM)生物样品观察法  103
    5.4.9 MTT比色法检测细胞活力  103-104
    5.4.10 细胞死亡检测法(PI/Hoechst染色)  104
    5.4.11 石蜡切片制作方法  104
    5.4.12 HE(苏木精-伊红)染色方法  104-105
    5.4.13 免疫荧光检测法  105
    5.4.14 数据分析  105
  5.5 实验结果和讨论  105-129
    5.5.1 稀土上转换发光材料能够诱导细胞自噬  105-107
    5.5.2 稀土上转换发光材料诱导的细胞自噬是一个完整的过程  107-112
    5.5.3 RE-1通过降低稀土上转换发光纳米材料与细胞的相互作用有效屏蔽其诱导细胞自噬的能力  112-119
    5.5.4 RE-1降低稀土上转换发光纳米材料细胞中的毒性  119-121
    5.5.5 RE-1类似物对稀土上转换发光纳米材料自噬能力和细胞毒性的影响  121-125
    5.5.6 RE-1屏蔽稀土上转换发光纳米材料在小鼠体内肝脏组织诱导的自噬效应  125-128
    5.5.7 RE-1屏蔽稀土上转换发光纳米材料在小鼠体内引发的肝损伤  128-129
  5.6 本章小结  129-131
第6章 RGD-RE-1双功能短肽提高稀土纳米材料与癌细胞的相互作用及细胞自噬效应  131-141
  6.1 引言  131
  6.2 实验材料  131-132
    6.2.1 试剂  131
    6.2.2 细胞株  131-132
    6.2.3 实验装置及耗材  132
  6.3 仪器和设备  132
  6.4 实验方法  132-133
    6.4.1 RE-1-RGD与UCN的结合方法  132
    6.4.2 RE-1-RGD荧光值与浓度关系标准曲线的建立  132-133
    6.4.3 RE-1-RGD与UCN结合浓度的鉴定方法  133
  6.5 实验结果和讨论  133-139
    6.5.1 确定RE-1-RGD与UCN的结合浓度  133
    6.5.2 RE-1-RGD与RE-1一样也能够降低UCN的沉降速度  133-134
    6.5.3 RE-1-RGD增强UCN与细胞间的特异性相互作用  134-136
    6.5.4 RE-1-RGD增强UCN诱导细胞自噬的能力和细胞毒性  136-139
  6.6 本章小结  139-141
第7章 结论与展望  141-145
  7.1 本文总结  141-142
  7.2 RE-1短肽应用展望  142-145
    7.2.1 RE-1在检测及诊断方面—可能的应用案例  142-143
    7.2.2 RE-1在新材料开发领域—可能的应用案例  143-145
参考文献  145-159
致谢  159-161
缩略语  161-163
附录  163-174
  攻读博士学位期间已发表和待发表的学术论文的学术论文  163
  攻读博士学位期间已申请和正在申请的发明专利  163-164
  攻读博士学位期间所获得的科研基金  164
  攻读博士学位期间所获得的学术奖励  164
  攻读博士学位期间所参加的学术会议  164-165
  发表论文复印件  165-174

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