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大肠杆菌O157：H7富集及快速检测方法的研究

作　者: 熊齐荣
导　师: 赖卫华
学　校: 南昌大学
专　业: 粮食、油脂及植物蛋白工程
关键词: 大肠杆菌O157：H7 多克隆抗体 单克隆抗体 免疫磁珠 免疫层析
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


大肠杆菌0157：H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的主要血清型,能够导致腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症和血栓形成的血小板减少性紫癜等病症,该菌的流行暴发大多与食用被该菌污染的食物有关,因此建立快速、简单、灵敏度高和特异性强的检测方法对于该菌的防控具有重要意义。本文建立了免疫磁珠分离富集和胶体金免疫层析试纸条相结合的方法,用于大肠杆菌0157：H7的快速检测。本研究以0.3%甲醛灭活的大肠杆菌0157：H7菌体作为免疫原制备了两组兔多抗,间接ELISA测得纯化后的效价分别为1/6.4×105和1/1.28×106；以酸洗脱法提取的鞭毛蛋白免疫Balb/c小鼠制备单抗,获得了3株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(10C5-H3-B6、8C2和8B1-C2-B1),其制备的腹水纯化后效价分别为1/6.4×106、1/1.6×104和1/1.28×105, Western-blots结果显示单抗10C5-H3-B6针对的抗原表位为菌体脂多糖(LPS),单抗8C2针对的抗原表位为鞭毛蛋白。本研究采用EDC/NHSS化学偶联法制备免疫磁珠,对免疫磁珠进行了表征,按实际捕获效果来确定免疫磁珠制备工艺,对免疫磁珠添加量、孵育时间、分离时间等进行了优化,评价了其特异性及在食品基质样品中的捕获效果。结果显示：单抗10C5-H3-B6免疫磁珠捕获率为99.9%,偶联时抗体加入量为50μg/mg;经试验优化,确定在1mL体系中免疫磁珠加入量为0.05mg,室温孵育时间为30min,磁分离时间为3min。该免疫磁珠特异性良好,在牛肉和牛奶基质中的捕获率分别为94.4%和99.8%,而商品化的Dynabeads anti-0157免疫磁珠在牛肉馅和牛奶基质中的捕获率分别为72.8%和95.8%。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,胶体金标记单抗10C5-H3-B6后喷于金标垫上,NC膜上依次喷2号兔多抗和驴抗鼠多抗作为检测线和质控线,研制了大肠杆菌0157：H7胶体金快速检测试纸条,以此为基础建立了胶体金免疫层析试纸条相结合的检测方法,并对该方法进行了评价。采用胶体金试纸条读取仪读取试纸条上T线和C线的光密度值,以菌浓度的对数值为横坐标,T/C比值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：制备的胶体金检测卡灵敏度较高、特异性好,通过与免疫磁珠富集方法联用,检测灵敏度达到7.6×103CFU/mL,比直接滴加于检测卡提高了一个数量级。该试纸条加样20min后,T/C数值趋于稳定,试纸条检测3组不同浓度菌液的T/C值变异系数分别为7.4%、7.6%和10.4%(n=18),绘制的标准曲线相关系数R2为0.987。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
缩略语表  7-13
第一章 前言  13-23
  1.1 大肠杆菌O157：H7概述  13-15
    1.1.1 大肠杆菌O157：H7的生理生化特性  13-14
    1.1.2 大肠杆菌O157：H7的毒力因子及致病机理  14
    1.1.3 大肠杆菌O157：H7感染的临床表现  14
    1.1.4 大肠杆菌O157：H7的传播途径及流行现状  14-15
  1.2 大肠杆菌O157：H7抗体制备研究进展  15-17
    1.2.1 多克隆和单克隆抗体概念  15-16
    1.2.2 抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体的制备  16-17
  1.3 大肠杆菌O157：H7检测技术研究进展  17-21
    1.3.1 传统分离鉴定法  17
    1.3.2 分子生物学检测方法  17-18
    1.3.3 免疫学检测方法  18-20
    1.3.4 其他检测方法  20-21
  1.4 免疫磁分离技术应用进展  21-22
    1.4.1 免疫磁分离技术概述  21
    1.4.2 免疫磁技术应用于大肠杆菌O157：H7检测的研究进展  21-22
  1.5 本文的研究内容和意义  22-23
第二章 大肠杆菌O157：H7抗体的制备和鉴定  23-36
  2.1 材料与仪器  23-25
    2.1.1 菌株及免疫动物  23-24
    2.1.2 主要试剂及材料  24
    2.1.3 主要仪器设备  24
    2.1.4 主要试剂的配制  24-25
  2.2 实验方法  25-31
    2.2.1 免疫原的制备  25-26
    2.2.2 多克隆抗体的制备  26-27
    2.2.3 单克隆抗体的制备  27-29
    2.2.4 抗体浓度和纯度测定  29
    2.2.5 抗体鉴定  29-31
  2.3 结果与分析  31-35
    2.3.1 SDS-PAGE电泳分析抗体纯化效果  31
    2.3.2 抗体浓度和效价  31-32
    2.3.3 单抗亚型鉴定结果  32
    2.3.4 免疫斑点杂交法鉴定抗体特异性  32-34
    2.3.5 SDS-PAGE和Western-b1ots结果  34-35
    2.3.6 免疫胶体金电镜观察结果  35
  2.4 讨论  35-36
第三章 大肠杆菌O157：H7免疫磁珠分离富集方法的建立  36-48
  3.1 材料与仪器  36-37
    3.1.1 菌株  36
    3.1.2 主要试剂及材料  36-37
    3.1.3 主要仪器设备  37
    3.1.4 相关试剂和培养基的配制  37
  3.2 实验方法  37-41
    3.2.1 确定适合用于制备免疫磁珠的抗体  37-38
    3.2.2 确定制备每mg免疫磁珠所需单抗10C5-H3-B6的量  38
    3.2.3 制备一批单抗免疫磁珠并对其进行水化粒径分析  38
    3.2.4 确定捕获1mL 10~(4～5) CFU/mL菌液所需免疫磁珠的量  38-39
    3.2.5 确定所需的最短孵育时间  39
    3.2.6 确定所需最短分离时间  39
    3.2.7 确定0.05mg单抗免疫磁珠最高捕获浓度  39
    3.2.8 评价单抗免疫磁珠特异性  39
    3.2.9 存在杂菌干扰时免疫磁珠的捕获效率  39-40
    3.2.10 在实际样本中的捕获效果  40-41
  3.3 结果与分析  41-47
    3.3.1 Nicomp380纳米粒度分析仪监测磁珠水化粒径变化  41-42
    3.3.2 不同抗体制备的免疫磁珠捕获效果  42
    3.3.3 确定制备每mg免疫磁珠所需添加单抗10C5-H3-B6的量  42
    3.3.4 确定捕获1mL 10~5CFU/mL菌液所需添加免疫磁珠的量  42-43
    3.3.5 免疫反应时间对捕获效率的影响  43-44
    3.3.6 磁分离时间对免疫磁捕获效率的影响  44-45
    3.3.7 对1mL 10~1～10~8CFU/mL不同浓度菌液的捕获  45
    3.3.8 免疫磁珠特异性  45-46
    3.3.9 杂菌存在下对免疫磁珠捕获目标菌的影响  46
    3.3.10 在实际样本中的捕获  46-47
  3.4 讨论  47-48
第四章 结合免疫磁珠分离富集的大肠杆菌O157：H7胶体金免疫层析检测方法的建立  48-58
  4.1 材料与仪器  49
    4.1.1 菌株  49
    4.1.2 主要材料和仪器设备  49
    4.1.3 相关试剂与培养基配制  49
  4.2 实验方法  49-52
    4.2.1 胶体金的制备  49-50
    4.2.2 胶体金的标记  50
    4.2.3 胶体金免疫层析检测卡的组装  50-51
    4.2.4 胶体金免疫层析检测卡的评价  51
    4.2.5 结合磁分离富集的胶体金免疫层析检测  51-52
  4.3 结果与分析  52-57
    4.3.1 胶体金颗粒分析  52
    4.3.2 胶体金免疫层析试纸条特异性  52-54
    4.3.3 试纸条阴性样品的检测  54-55
    4.3.4 结合磁分离富集的胶体金免疫层析检测  55-57
  4.4 讨论  57-58
第五章 胶体金免疫层析定量检测方法的初步研究  58-65
  5.1 材料与仪器  58-59
    5.1.1 菌株  58
    5.1.2 主要材料和仪器设备  58
    5.1.3 相关试剂与培养基配制  58-59
  5.2 实验方法  59-60
    5.2.1 确定胶体金试纸条读数时间  59
    5.2.2 测试胶体金试纸条读取仪的稳定性  59
    5.2.3 测试制备的胶体金试纸条稳定性  59
    5.2.4 绘制胶体金试纸条定量检测标准曲线  59
    5.2.5 试纸条定量测定值和平板计数结果的符合率  59-60
  5.3 结果与分析  60-63
    5.3.1 胶体金试纸条读取时间的确定  60-61
    5.3.2 胶体金试纸条读取仪的稳定性测试  61
    5.3.3 胶体金试纸条稳定性测试  61-62
    5.3.4 胶体金试纸条定量检测标准曲线  62-63
    5.3.5 试纸条定量测定值和平板计数结果的比较  63
  5.4 讨论  63-65
第六章 结论与展望  65-67
  6.1 结论  65-66
    6.1.1 大肠杆菌O157：H7抗体的制备及鉴定  65
    6.1.2 大肠杆菌O157：H7免疫磁珠分离富集方法的建立  65
    6.1.3 结合免疫磁分离富集的大肠杆菌O157：H7免疫层析检测方法的建立  65
    6.1.4 胶体金免疫层析定量检测方法的初步研究  65-66
  6.2 展望  66-67
致谢  67-68
参考文献  68-74
附录1 菌种目录  74-76
附录2 仪器设备  76-77
附录3 试剂药品  77-79
个人介绍  79
攻读学位期间的研究成果  79

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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