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黑曲霉糖化酶基因在酵母中克隆和表达

作　者: 钱鹏
导　师: 汤斌; 宋宗庆
学　校: 安徽工程大学
专　业: 发酵工程
关键词: 黑曲霉糖化酶毕赤酵母酿酒酵母克隆表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,是一种外切型糖苷酶,含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,分子量在50kD-112kD之间,通常碳水化合物占总量的3.2%-20%。其功能在于从淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非还原性末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶底物专一性较低,它除了能从非还原性末端断裂a-1,4-糖苷键外,也能水解a-1,6-糖苷键和a-1,3-糖苷键。该酶广泛分布于细菌、古细菌和真核生物中。在工业上用于将淀粉转化为葡萄糖,因而广泛地用于制药、酿酒及食品发酵工业中,是最重要的工业酶制剂之一。目前,年产量约70000t,是中国产量最大的酶种。本文从高产糖化酶的黑曲霉BU11-36的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,经Sac I酶切线性化开后,通过电穿孔法将线性重组质粒整合到毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6U/mL。测序结果显示其糖化酶大小为1908bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子量大约为80k Da。重组糖化酶酶学特性测定显示：该酶最适反应pH和温度分别为5.0和50℃Cu2+对重组糖化酶的抑制作用明显强于Fe3+、Ca2+、Zn2+。非离子型的表面活性剂(TritionX-100、吐温-20、吐温-80)对糖化酶有提高的作用,而阴离子表面活性剂(SDS)对糖化酶有抑制作用。利用相同的方法将黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pYES2相连,构建重组载体,电转化酿酒酵母INVScl,经碘熏染法筛选阳性克隆并进行研究。重组酿酒酵母的糖化酶最大酶活为4.3u/mL,重组酿酒酵母糖化酶的最适反应温度为55℃。重组糖化酶的最适反应pH为4.0,淀粉水解力大约为60%,重组酿酒酵母的酒精发酵能力为3.5%。SDS-PAGE电泳显示重组酿酒酵母分泌蛋白的分子量约为70kD。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第1章绪论  13-24
  1.1 选题意义  13-14
  1.2 糖化酶  14-19
    1.2.1 糖化酶的来源及性质  14-16
    1.2.2 糖化酶的酶活检测  16
    1.2.3 糖化酶的生产方式  16-17
    1.2.4 黑曲霉糖化酶基因的研究进展  17-19
  1.3 毕赤酵母表达体系的研究  19-21
    1.3.1 毕赤酵母表达系统  19-20
    1.3.2 毕赤酵母表达系统的类型  20
    1.3.3 影响毕赤酵母中外源蛋白表达水平的主要因素  20-21
    1.3.4 毕赤酵母表达系统重组蛋白的方法  21
  1.4 酿酒酵母表达体系  21-23
    1.4.1 酿酒酵母  21-22
    1.4.2 酿酒酵母系统的分类  22-23
  1.5 本研究的目的和内容  23-24
    1.5.1 研究目的  23
    1.5.2 研究内容  23-24
第2章黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母的克隆表达  24-53
  2.1 实验材料  24-27
    2.1.1 菌种及载体  24-25
    2.1.2 培养基  25
    2.1.3 主要试剂  25-26
    2.1.4 器材与仪器  26-27
  2.2 实验方法  27-40
    2.2.1 菌丝体预处理  27
    2.2.2 总RNA提取  27
    2.2.3 mRNA提取  27-28
    2.2.4 cDNA双链全长合成  28-30
    2.2.3 接头连接  30
    2.2.4 Not Ⅰ酶切  30
    2.2.5 去除短链cDNA  30-32
    2.2.6 pPIC9K原核宿主菌的培养及质粒pPIC9K提取  32
    2.2.7 质粒EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切  32-33
    2.2.8 表达质粒pPIC9K-cDNA的构建  33
    2.2.9 毕赤酵母GS115感受态制备  33-34
    2.2.10 毕赤酵母GS115转化  34-35
    2.2.11 阳性克隆的筛选及测序分析  35-37
    2.2.12 发酵性能的测定  37-38
      2.2.12.1 用甲醇诱导重组毕赤酵母发酵产酶  37-38
      2.2.12.2 重组表达酶的性质分析  38
    2.2.13 发酵液纯化及SDS-PAGE  38-40
  2.3 实验结果  40-51
    2.3.1 黑曲霉总mRNA的提取  40-41
    2.3.2 pPI9K质粒的提取结果  41-42
    2.3.4 阳性克隆PCR  42
    2.3.5 测序及序列分析  42-44
    2.3.6 重组毕赤酵母糖化酶酶活测定  44-46
    2.3.7 重组毕赤酵母糖化酶酶性质的研究  46-47
    2.3.8 金属离子对重组毕赤酵母糖化酶酶活的研究  47-50
    2.3.9 SDS-PAGE电泳分析重组毕赤酵母分泌表达糖化酶  50-51
  2.4. 结论  51-53
    2.4.1 实验小结  51
    2.4.2 实验讨论  51-53
第3章黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母的克隆表达  53-71
  3.1 实验材料  53-56
    3.1.1 菌种  53-54
    3.1.2 培养基  54-55
    3.1.3 主要试剂及仪器  55-56
      3.1.3.1 主要试剂  55
      3.1.3.2 主要仪器  55-56
  3.2 试验方法  56-62
    3.2.1 质粒pYES2的提取  56
    3.2.2 菌丝体预处理  56
    3.2.3 总RNA提取  56
    3.2.4 mRNA提取  56
    3.2.5 cDNA方法的合成  56
    3.2.6 质粒双酶切  56-57
    3.2.7 表达质粒pYES2-cDNA的构建  57
    3.2.8 酿酒酵母INVScl感受态制备及电转化  57-58
    3.2.9 阳性克隆的筛选  58-59
      3.2.9.1 挑选的阳性克隆质粒的抽提  58-59
      3.2.9.2 EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切验证  59
    3.2.10 双酶切后的质DNA的纯化  59
    3.2.11 目的片段的纯化  59
    3.2.12 大肠杆菌感受态细胞制备  59
    3.2.13 载体连接  59
    3.2.14 转化  59
    3.2.15 阳性克隆的筛选  59-60
    3.2.16 测序  60
    3.2.17 糖化酶酶活检测  60-61
    3.2.18 重组毕赤酵母糖化酶酶学的性质分析  61
    3.2.19 发酵液中酒精含量的测定  61-62
    3.2.20 纯化和SDS-PAGE电泳  62
  3.3 实验结果  62-70
    3.3.1 pYES2质粒的提取  62
    3.3.2 阳性克隆的筛选  62-63
    3.3.3 重组质粒的酶切鉴定  63-64
    3.3.4 测序及序列分析  64
    3.3.5 重组酿酒酵母糖化酶酶活  64-67
      3.3.5.1 葡萄糖标准曲线  65
      3.3.5.2 重组酿酒酵母糖化酶酶学性质的研究  65-67
    3.3.6 重组酿酒酵母酒精发酵能力的测定  67-68
      3.3.6.1 酒精标准曲线的测定  67
      3.3.6.2 重组酿酒酵母酒精发酵能力的测定  67-68
    3.3.7 SDS-PAGE电泳  68-69
    3.3.8 重组质粒在酿酒酵母工程菌中的稳定性  69-70
  3.4 实验小结  70-71
    3.4.1 实验结论  70
    3.4.2 实验讨论  70-71
第4章结论与展望  71-73
  4.1 实验结论  71
  4.2 展望  71-73
参考文献  73-79
攻读硕士期间发表论文情况  79-80
致谢  80

黑曲霉糖化酶基因在酵母中克隆和表达

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