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基于核酸适配体化学发光生物传感技术的研究

作　者: 彭倩雯
导　师: 卢建忠
学　校: 复旦大学
专　业: 药物分析学
关键词: 核酸适配体 化学发光 生物传感技术 磁性微球 96孔板 聚苯乙烯微球 滚环扩增放大 DNAzyme
分类号: TP212.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


适配体是指利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术,从人工合成的寡核苷酸文库中筛选获得的能够与靶分子高亲和、高特异性结合的寡聚核苷酸片段(单链DNA或RNA)。适配体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似,但适配体作用的靶分子范围极广,可特异性结合细胞、蛋白质、氨基酸、药物和金属离子等,它的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新型的高效快速识别的研究平台。核酸适配体自身稳定性好、变性复性快速可逆、目标分子范围广特异性和亲和性高、化学合成相对简单、快速、容易获得、易于修饰与标记,且在生物传感器设计中应用灵活等优点,近几年在生物分析检测方面备受关注。目前已经成为临床诊断、环境监测、生物医学、药学研究等许多领域中的研究热点。化学发光(CL)分析法是根据化学反应产生的光辐射确定物质含量的一种痕量分析方法。化学发光分析法具有不需激发光源,避免了杂散光的干扰,仪器设备简单、操作简便,线性范围宽(3-6个数量级),具有极高的灵敏度,有利于实现全自动化检测等特点,正逐渐成为分析检测中富有价值的工具。随着与其它学科的交叉研究和应用领域的扩展,目前已成功地应用在药学、生物学、分子生物学、临床医学和环境学等诸多领域。在本论文中,我们采用化学发光分析法,利用核酸适配体对目标分子的高分辨识别的特性,发展了三种具有创新意义的基于适配体识别的化学发光生物传感器。全文由以下四部分组成：第一章概述了核酸适配体的制备、特点和优势,及其在相关检测领域的应用,并着重介绍了基于核酸适配体的生物传感器的研究进展,包括无标记、标记检测技术以及信号放大体系在核酸适配体生物传感器的应用,并列举了该检测技术在近几年的部分典型示例,最后简单介绍了化学发光检测技术以及本课题的主要研究内容。第二章介绍了采用聚苯乙烯微球作为放大载体,构建了高灵敏度磁性微球表面瞬时衍生化学发光IgE检测技术。首先将IgE抗体固定在羧基化磁性微球上随后与抗原IgE结合,再与聚苯乙烯微球上修饰的IgE适配体特异结合,洗涤后利用特异性化学发光试剂TMPG与磁性微球表面捕获的鸟嘌呤(G)碱基反应产生化学发光,实现了IgE的无标记检测；随后在IgE适配体序列5‘末端修饰富含G碱基的(GGT)n片段,进一步提高了检测灵敏度。最低检测浓度可达4.60 pM,线性范围为4.88 pM-20 nM(1gI=0.7573 1gC+2.4529,R2=0.9853).第三章以羧基修饰的96孔板为载体,通过羧基-氨基反应固定PDGF-BB单克隆抗体,与目标蛋白PDGF-BB特异性结合后,结合核酸适配体-引物序列,该序列含有两个功能区：一个用于特异性识别目标蛋白PDGF-BB;另一个在3’末端含有一段可触发滚环扩增放大(RCA)反应的引物。该引物在环状模板及一系列酶存在下,经过RCA反应后,可得到一条含有多个与环形DNA模板互补的重复序列单元的DNA单链,从而能够杂交结合许多生物素标记的互补寡核苷酸报告探针。随后结合链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶(HRP),洗涤后测定96孔板上保留的HRP产生的化学发光,定量PDGF-BB。RCA放大体系中PDGF.BB的线性范围为10 fM-1 nM(1gI=0.8791gC-0.446,R2=0.998),最低检测浓度可达10 fM,RCA反应后检测灵敏度提高了1000倍。第四章是基于适配体与目标分子之间的结合能力大于互补DNA双链之间的相互作用,建立了一种均相检测腺苷的技术平台。我们首先将腺苷适配体序列与含有能与血红素分子形成四聚体结构的特殊序列GGG TAG GGC GGG TTG GG杂交；腺苷加入后与适配体序列结合,释放出四聚体序列；四聚体序列与血红素分子形成DNAzyme,催化Luminol和H202产生CL,检测腺苷。实验结果表明：该法具有操作简便和分析快速等特点,干扰试验表明该技术有一定的特异性识别能力。目标分子腺苷浓度在7.81×10-6-5.00×10-4M浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.9670,检测限可达到7.81×10-6 M。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
第一章 绪论  9-33
  第一节 核酸适配体的概述  9-12
  第二节 核酸适配体在生物传感器中的应用  12-24
  第三节 本课题的主要研究内容及创新点  24-25
  参考文献  25-33
第二章 基于核酸适配体的化学发光瞬时衍生检测IgE的新技术  33-51
  第一节 引言  34-35
  第二节 实验部分  35-37
  第三节 结果和讨论  37-47
  第四节 结论  47
  参考文献  47-51
第三章 基于核酸适配体的滚环扩增技术检测PDGF-BB的新技术  51-66
  第一节 引言  52-53
  第二节 实验部分  53-55
  第三节 结果和讨论  55-62
  第四节 结论  62-63
  参考文献  63-66
第四章 基于适配体的DNAzyme催化化学发光检测腺苷新技术  66-77
  第一节 引言  67
  第二节 实验部分  67-69
  第三节 结果和讨论  69-74
  第四节 结论  74
  参考文献  74-77
发表论文  77-78
致谢  78-79

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中图分类: > 工业技术 > 自动化技术、计算机技术 > 自动化技术及设备 > 自动化元件、部件 > 发送器（变换器）、传感器 > 生物传感器、医学传感器
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