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类固醇性激素化学发光免疫分析方法的研究

作　者: 辛天兵
导　师: 梁淑轩；林金明
学　校: 河北大学
专　业: 应用化学
关键词: 化学发光免疫分析(CLIA) 磁性微粒子(MPs) 雌二醇(E2) 孕酮(P) 三氯醋酸钠
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

免疫分析方法具有灵敏度高、线性范围宽、可实现全自动化等优点,在生命、环境科学领域得到了广泛的应用。它主要包括放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析以及化学发光免疫分析等方法。本论文主要围绕化学发光免疫分析技术,开展了测定类固醇性激素的一系列研究,对大批量样品筛选和检测方面有非常重要的学术意义和应用价值。全文主要分为五章,分述如下：第一章在介绍类固醇性激素的种类、来源和作用功能的基础上,对类固醇性激素检测技术和方法进行了综述。此外,本章还概述了化学发光免疫分析的基本原理、方法和研究进展,并对其研究前景进行了展望。第二章建立了一种简便、快速、高灵敏度的化学发光酶免疫分析法测定环境水中的17β-雌二醇。采用二抗包被的磁颗粒作为免疫分析体系的固相分离剂。本法测定实际样品时,使用固相萃取方法进行样品前处理,以消除基体效应的干扰。除此以外,对各种实验影响因素(如免疫试剂的稀释度、免疫反应条件、磁颗粒和发光底物体积、发光底物反应时间和pH值等)进行了考查和优化。在最优条件下,测定E2的线性范围是20～1200 pg/mL,检测限为2.0 pg/mL。体系测定样品的总时间在45 min以内,批内和批间变异系数均小于10%,加入不同样品浓度的平均回收率是86.3～108%。本方法已成功用于废水、河水以及自来水中E2的测定,与商业化的放射免疫分析(RIA)试剂盒相比,具有良好的相关性。第三章以磁性微粒子为载体,建立了一种高灵敏度、高特异性和重现性化学发光免疫分析方法,并将其应用于血清中雌二醇(E2)的测定。采用二抗包被的磁颗粒作为免疫分析体系的固相分离剂,选择高灵敏度的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)催化H2O2-luminol化学发光体系作为检测体系。本方法表现出高特异性,与主要的类固醇激素如：雌酮(E1)、雌三醇(E3)、二氢睾酮(DHT)、雄烯二酮和睾酮等均没有交叉。阻断剂三氯醋酸钠的引入,可以不需要萃取,实现对人血清中雌二醇的直接测定。在最佳条件下,本法测定雌二醇的检测限为2.51 pg/mL,线性范围为15～1000 pg/mL,体系批内和批间变异均小于15%。对三种不同加入浓度样品的平均回收率分别为93.3、106、101%。本方法已成功应用到105份临床人血清样品的测定,与商品化的放射免疫试剂盒的检测结果相关性良好,其相关系数为0.9892。以上结果可望在开发国产化化学发光诊断试剂盒和全自动化学发光免疫分析仪中得到应用。第四章本法依据HRP的标记物和雌二醇抗原与一定量的抗体之间的竞争反应,采用驴抗兔二抗包被聚苯乙烯板作为免疫分析体系的固相,选择高灵敏度的辣根过氧化酶催化H2O2-luminol化学发光体系作为检测体系。本方法测定雌二醇的检测限为1.48 pg/mL,并成功应用到97份临床人血清样品的测定,与商品化的放射免疫试剂盒的检测结果相关性良好,其相关系数为0.9881,能够满足日常临床诊断的需求。第五章采用磁性微粒子作为分散固相及分离剂,以HRP催化H2O2-luminol化学发光体系作为检测体系。在反应体系中引入偶联羊抗兔二抗的磁性微粒子,并最终形成免疫复合物。在反复施加磁场的作用下,通过洗涤将没有结合的游离蛋白与免疫复合物分离,即可实现对待测抗原的测定。在最佳条件下,本法测定孕酮的检测限为0.2 ng/mL线性范围为0～100 ng/mL,体系批内和批间变异均小于11%。以本法测定了70份临床血清样品,回收率为82～112%,与商品化进口化学发光免疫试剂盒的检测结果相关性良好,相关系数为0.9897。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章化学发光免疫分析在类固醇性激素检测中的应用及进展  13-26
  1.1 引言  13
  1.2 类固醇性激素  13-15
    1.2.1 雄性激素  14
    1.2.2 孕激素  14
    1.2.3 雌激素  14-15
  1.3 化学发光免疫分析法的应用和进展  15-25
    1.3.1 化学发光免疫分析基本原理  16-18
    1.3.2 化学发光免疫分析方法的主要类型  18-23
    1.3.3 化学发光免疫分析方法的研究进展  23-25
  1.4 研究展望  25-26
第2章磁性微粒子化学发光酶免疫分析法测定环境水中17β-雌二醇  26-38
  2.1 引言  26-28
  2.2 实验部分  28-30
    2.2.1 仪器  28
    2.2.2 试剂  28
    2.2.3 缓冲溶液和校准品  28
    2.2.4 抗体的制备和纯化  28
    2.2.5 磁颗粒化学发光免疫分析步骤  28-29
    2.2.6 放射免疫法  29
    2.2.7 数据处理  29-30
    2.2.8 交叉反应的测定  30
    2.2.9 样品前处理  30
  2.3 结果和讨论  30-37
    2.3.1 免疫试剂的优化  30-31
    2.3.2 免疫反应时间和发光底物体积的优化  31-32
    2.3.3 磁颗粒体积的优化  32-33
    2.3.4 化学发光反应动力学  33
    2.3.5 pH值的影响  33-34
    2.3.6 方法学评价  34-35
    2.3.7 实际水样中E_2的分析  35-37
  2.4 结论  37-38
第3章磁性微粒子化学发光免疫分析法测定人血清中雌二醇  38-50
  3.1 引言  38-40
  3.2 实验部分  40-41
    3.2.1 仪器和试剂  40
    3.2.2 校准品  40
    3.2.3 去激素人血清的制备  40
    3.2.4 免疫分析步骤  40-41
    3.2.5 样品  41
  3.3 结果和讨论  41-49
    3.3.1 免疫试剂的优化  41-42
    3.3.2 校准品基质的影响  42-43
    3.3.3 阻断剂的影响  43-44
    3.3.4 实验条件的优化  44-46
    3.3.5 方法学评价  46-49
    3.3.6 实际血清样品的测定  49
  3.4 结论  49-50
第4章高灵敏度、高通量二抗固相化学发光免疫分析测定人血清中雌二醇方法的建立  50-60
  4.1 引言  50-51
  4.2 实验部分  51-52
    4.2.1 仪器和试剂  51
    4.2.2 实验方法  51-52
  4.3 结果和讨论  52-59
    4.3.1 二抗间接包被和雌二醇抗体直接包被的对照  52-53
    4.3.2 二抗用量的优化  53
    4.3.3 免疫试剂的优化  53-54
    4.3.4 阻断剂的影响  54-55
    4.3.5 免疫反应条件的优化  55-56
    4.3.6 化学发光底物体积的优化  56
    4.3.7 化学发光反应动力学  56-57
    4.3.8 方法学评价  57
    4.3.9 实际样品的测定  57-59
  4.4 结论  59-60
第5章磁性微粒子化学发光免疫分析法测定人血清中的孕酮  60-68
  5.1 引言  60-61
  5.2 实验部分  61-62
    5.2.1 仪器  61
    5.2.2 试剂  61
    5.2.3 校准品  61
    5.2.4 实验方法  61-62
  5.3 结果与讨论  62-67
    5.3.1 免疫试剂用量的影响  62
    5.3.2 阻断剂的影响  62-63
    5.3.3 免疫反应时间的影响  63-64
    5.3.4 磁颗粒体积的影响  64-65
    5.3.5 发光底物液体积的影响  65
    5.3.6 方法学参数  65-66
    5.3.7 实际样品分析  66-67
  5.4 结论  67-68
第6章结论与展望  68-70
  6.1 结论  68
  6.2 展望  68-70
参考文献  70-77
附录硕士期间主要研究成果  77-79
致谢  79

类固醇性激素化学发光免疫分析方法的研究

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