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抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素介导的MAPK信号通路的影响

作　者: 刘林
导　师: 张赤志
学　校: 湖北中医学院
专　业: 中医内科学
关键词: 制备工艺肝星状细胞增殖凋亡整合素黏着斑激酶细胞外信号调节激酶 @抗纤软肝颗粒
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的肝纤维化(liver fibrosis，LF)为各种慢性肝疾患所导致的一系列损伤-修复，最终肝组织内细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)过度沉积的反应。由于发生的机制比较复杂，至今对肝纤维化的了解还很有限，因此制约了肝纤维化治疗的发展。肝星状细胞(Hepatic Stellate cell，HSC)作为ECM的主要生成细胞，被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。在肝纤维化的发生发展机制中，对肝星状细胞激活的启动、维持，细胞外基质也起着重要的作用。HSC与ECM之间存在着复杂的相互作用，而其相互作用主要经整合素介导。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是整合素信号途径中连接整合素与下游信号分子的媒介，是胞内多个信号途径的交汇点。其中，以FAK为中心的整合素信号转导通路主要是Ras-MAPK途径，细胞外信号调节激酶1／2(extracellularsignal-regulated kinase，ERK1／2)是MAPK家族中研究最为清楚的成员，其通路Ras-RAF-MEK-ERK参与细胞多种活动。抗纤软肝颗粒组方在临床上有良好的疗效，现将其制成适应临床需要的颗粒剂。在既往研究的基础上，应用体外细胞培养技术，从肝星状细胞与细胞外基质的相互作用着手，以整合素、FAK、ERK1／2为研究切入点，研究抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素信号通路的影响，由此阐释抗纤软肝颗粒抗肝星状细胞增殖与诱导凋亡的作用机制。方法：(1)首先根据处方中丹参、莪术及鳖甲所含化学成分的理化性质及其药理作用，以提取丹参酮ⅡA和莪术挥发油为目的，确定抗纤软肝颗粒的制备制成工艺，用正交设计的直观分析优化几种辅料的用量确定最终的制剂处方。(2)考察成品的体外溶出度；同时对之进行全面的质量控制研究，制定质量标准。(3)运用体外细胞培养技术，以HSC-T6细胞系为研究对象，分为空白包被＋10％生理盐水血清组、FN包被＋10％生理盐水血清组、FN包被＋5％kxr组、FN包被＋10％kxr组、FN包被＋20％kxr组。按以上分组进行药物干预，各组FN(3μg／ml)均于kxr加入前30分钟加入，干预后继续培养48h。(4)采用MTT法测细胞增殖，采用甲苯胺蓝染色方法测定细胞黏附率；Annexin V-PE／7-ADD法测定Hsc凋亡。(5)应用免疫细胞组织化学方法检测HSC整合素α5β1蛋白的表达。(6)应用免疫细胞组织化学方法检测HSC FAK蛋白的表达，采用RT-PCR法测定FAKmRNA的表达。(7)应用免疫细胞组织化学方法检测HSC ERK1蛋白的表达，采用RT-PCR法测定ERK1mRNA的表达。结果：(1)丹参的渗漉最佳工艺为：用90％的乙醇进行渗漉，流速为0.6ml／min，乙醇用量为12倍，浸泡时间为16h；鳖甲超微粉碎后置显微镜下观察，可见粒径小于5um的多于50％，粒径小于10um的多于90％；莪术挥发油的最佳提取工艺为加水8倍，浸泡时间为0.5h，煎煮5h。莪术挥发油的最佳包合工艺为挥发油：β-CD(1∶4)，搅拌时间为60min，包合温度为50℃，以10000r／min的转速进行包合。制备工艺中确定以糊精为辅料，药物：糊精：1∶0.5，以50％乙醇为润湿剂，加入0.4％倍CMC作为助悬剂，过16目筛制粒，50℃干燥，10目筛整粒。(2)含量测定方法学考察实验中，其回收率合格，精密度、稳定性和重现性良好，说明了所制定的含量测定方法的合理性和可行性；样品在考察期各项指标无明显变化，均符合规定。(3)与FN组比较，kxr各组均可以抑制HSC增殖，存在显著差异(P＜0.01)，kxr各组均可以诱导HSC凋亡，与FN组及空白对照组比较存在显著差异(P＜0.01)，与空白对照组比较，kxr各组均可以抑制FN与HSC的粘附，存在显著差异(P＜0.01)。(4)抗纤软肝颗粒含药血清组HSC的整合素α5β1蛋白表达显著下调，与空白对照组及FN组相比有显著性差异(P＜0.01) (5)抗纤软肝颗粒含药血清组HSC的FAKmRNA、蛋白表达均显著下调，分别减少了43.32％(11.93％)，56.52％(39.52％)，70.27％(53.42％)，与对照组及FN组相比，KXR1组(p＜0.05)，KXR2组、KXR3组(p＜0.01)，均有显著性差异。(6)抗纤软肝颗粒含药血清组HSC的ERK1mRNA、蛋白表达均显著下调，分别减少了39.53％(8.93％)，47.45％(35.62％)，56.78％(50.12％)，与对照组及FN组相比，KXR1组(p＜0.05)，KXR2组、KXR3组(p＜0.01)，均有显著性差异。结论(1)所确定的制备工艺稳定可行，质量控制方法合理可行。(2) FN能够刺激HSC增殖，由此可知细胞外基质通过整合素介导对肝星状细胞激活的启动、维持起着重要的作用。实验发现，抗纤软肝颗粒含药血清可以抑制由FN刺激的HSC增殖，并诱导HSC凋亡，并能抑制HSC的粘附，呈剂量依赖关系。抗纤软肝颗粒能够下调HSC整合素α5β1的表达，能够在转录及翻译水平抑制FAK及ERK1mRNA、蛋白的表达。(3)抗纤软肝颗粒含药血清有较好的抑制HSC增殖，并诱导HSC凋亡的作用，可能是通过以下途径实现的：抑制或拮抗了细胞外基质与其受体整合素的结合，从而抑制细胞外基质与HSC的粘附；通过下调整合素蛋白的表达，降低下游信号分子FAK及ERK1mRNA、蛋白的表达，阻抑了整合素激活的FAK信号途径中的Ras依赖的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，即Ras-RAF-MEK-ERK通路。这可能是其抗肝纤维化的作用靶点之一。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
英文缩略词表  10-11
前言  11-13
第一部分抗纤软肝颗粒剂型及质量控制的研究  13-56
  实验一抗纤软肝颗粒制备工艺的研究  13-27
    1 药品试剂与仪器  13
    2 制备方法  13-25
    3 讨论  25-26
    4 小结  26-27
  实验二抗纤软肝颗粒剂的制备  27-31
    1 仪器与材料  27
    2 方法与结果  27-30
    3 讨论  30
    4 小结  30-31
  实验三抗纤软肝颗粒剂的质量控制  31-40
    1 仪器与材料  31
    2 方法与结果  31-39
    3 讨论  39
    4 小结  39-40
  实验四抗纤软肝颗粒剂的初步稳定性研究  40-48
    1 仪器与材料  40
    2 方法与结果  40-47
    3 小结  47-48
  结语  48-49
  参考文献  49-56
第二部分抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素介导的MAPK信号通路的影响  56-81
  实验一抗纤软肝颗粒对FN诱导的肝星状细胞增殖、黏附、凋亡的影响  56-64
    1 材料与方法  56-58
    2 结果  58-60
    3 讨论  60-61
    参考文献  61-64
  实验二抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素α5β1蛋白表达的影响  64-68
    1 材料与方法  64-65
    2 结果  65
    3 讨论  65-66
    参考文献  66-68
  实验三抗纤软肝颗粒对肝星状细胞FAKmRNA、蛋白表达的影响  68-75
    1 材料与方法  68-71
    2 结果  71-72
    3 讨论  72-74
    参考文献  74-75
  实验四抗纤软肝颗粒对肝星状细胞ERK1mRNA、蛋白表达的影响  75-81
    1 材料与方法  75-77
    2 结果  77-78
    3 讨论  78-80
    参考文献  80-81
讨论与结论  81-92
  1 肝络痹阻,血瘀痰结是肝纤维化的基本病机  81-82
  2 肝络痹阻,血瘀痰结与肝星状细胞  82-83
  3 痰瘀阻络与粘附分子的关系  83-86
  4 抗纤软肝颗粒组方意义的探讨  86-87
  5 抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的信号转导机制探讨  87-91
  6 本课题创新之处及主要研究结果  91
  7 结语  91-92
参考文献  92-97
文献综述 I  97-109
文献综述 II  109-123
在校期间发表论文  123-124
致谢  124-125
附图  125-132

抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素介导的MAPK信号通路的影响

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