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猪视黄醇结合蛋白基因的转录、诱导转录及真核表达研究

作　者: 张冬杰
导　师: 刘娣
学　校: 东北农业大学
专　业: 动物遗传育种
关键词: 猪 视黄醇结合蛋白 维生素A 视黄酸受体 视黄酸X受体 甲状腺素运载蛋白
分类号: S828
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Proteins，RBPs)是体内一类将维生素A(VA)从肝中转运至靶组织以实现VA的细胞内转运代谢的特异的运载蛋白，在协助VA发挥生理功能中起着不可替代的作用。它先与VA结合再与甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)结合形成VA-RBP-TTR复合体，经血液流经靶组织后，与RBP的可识别受体(Retinoic acid receptor，RAR；retinoid X receptor，RXR)结合后，将VA转运至细胞内的受体，至此RBP完成其运载功能。RBP4既是一个影响猪的繁殖性状的候选基因，同时也是一个研究VA代谢障碍的候选基因。本研究以不同日龄大白猪为研究对象，采用RT-PCR法研究了RBP4 mRNA、RARs mRNA、RXRs mRNA和TTR mRNA在心脏、肝脏、胃、脾、肾脏、肺、大肠、小肠、肌肉、子宫和卵巢的转录情况；以猪的成纤维细胞系为研究对象，采用RT-PCR法研究了添加过量的VA后，RBP4 mRNA、RARs mRNA、RXRs mRNA和TTR mRNA的转录变化情况；采用ELISA和HPLC法检测了血清中RBP和VA的含量及与1月龄仔猪体重的关系；采用毕赤酵母真核表达系统构建了可被甲醇诱导表达的载体，主要研究结果如下：1．RBP4 mRNA在大白猪的脾脏和胃中不转录；在肝脏中是持续高转录；子宫中的转录水平在不同日龄间差异显著(P＜0.05)，且在90日龄时最低；卵巢中的转录情况是随着日龄的增加，转录水平也逐渐增加，180日龄时(性成熟期)达到最高，而后开始下降，至360日龄时最低。在心脏、肾脏、肺、大肠、小肠、肌肉也转录，但存在空间和时间的特异性。2．RARa mRNA在大白猪的肝脏、脾脏、肾脏、大肠、小肠、子宫和卵巢中持续转录，其中脾脏、大肠和小肠是持续高转录；180日龄时，所有组织的RARαmRNA的转录量普遍降低；360日龄时，所检的11个组织均高转录该基因。RARβmRNA在大白猪的心脏、肾脏、大肠、子宫和卵巢中持续转录，其中大肠、子宫和卵巢是持续高转录，在1日龄和360日龄的时候，所检的11个组织均转录该基因，且转录量较高；因RARβmRNA在子宫和卵巢的持续高表达，也可以考虑将其作为一个影响繁殖性状的候选基因来加以研究。RARγmRNA在大白猪的子宫和卵巢中持续转录，子宫中该基因的转录量一直持续较高，在360日龄时所检的11个组织均转录该基因，且转录量较高。3．RXRαmRNA在大白猪的肾脏、肺、小肠和肌肉组织中持续转录，而在心脏和子宫转录水平较低，1日龄时转录RXRαmRNA的组织最多，同时转录量也最高。RXRβmRNA在大白猪的脾脏、子宫和卵巢中持续转录，也是在1日龄时转录的组织最多且转录水平较高。RXRγmRNA在大白猪的心脏、脾脏、大肠、小肠和肌肉组织中持续转录，并且转录量一直持续较高，而肾脏不转录该基因。4．TTR mRNA在大白猪的肝脏、子宫和卵巢持续转录，且在肝脏中持续高转录，这与RBP4 mRNA的转录情况一致；1日龄时所检的11个组织均转录，且转录量较高，而90日龄时除了心脏、肝脏和胃外，其余组织的转录水平均较低。5．根据分析不同日龄不同组织中RBP4 mRNA的变化规律与RARs和RXRs mRNA的变化规律，推测出了所检的11个组织中，每个组织内可能与RBP4结合的核受体类型。6．在猪的成纤维细胞系中添加过量的VA后，在24-72h内可正调节RBP4 mRNA的转录；在72h的培养期内，RARα、RARβ和RARγmRNA的转录变化均是在12h和48h时最高，24h和72h时最低，但总体基本都处于对照组之下，也就是说过量的VA会负调节RARs mRNA的转录；与对照组相比，过量的VA正调节了RXRγmRNA的转录，而负调节RXRα和RXRβmRNA的转录。7．血清中RBP和VA的含量存在显著相关(P＜0.01)，但不存在线性关系；血清中RBP和VA的含量与1月龄体重均不存在显著性相关(P＞0.05)。8．从大白猪的肝脏组织的cDNA中，PCR扩增出猪RBP4成熟蛋白编码核苷酸序列，产物全长549bp，即为猪RBP4成熟蛋白183个氨基酸序列。9．构建了大白猪RBP4成熟蛋白编码序列的真核转录载体pPICZaC-RBP4，经PCR、酶切和测序检测分析，片段大小与理论相符，证明构建成功。10．成功的利用甲醇诱导真核转录质粒pPICZaC-RBP4在GS115酵母菌中的表达，并在蛋白水平上检测到了RBP4成熟蛋白的表达。

全文目录


中文摘要  12-14
英文摘要  14-16
1 文献综述  16-34
  1.1 影响母猪繁殖力的因素  16-17
    1.1.1 遗传因素  16
    1.1.2 营养因素  16-17
    1.1.3 环境因素  17
    1.1.4 管理因素  17
    1.1.5 疾病因素  17
  1.2 猪繁殖性状候选基因的研究进展  17-19
    1.2.1 雌激素受体基因  18
    1.2.2 卵泡刺激素基因β亚基  18-19
    1.2.3 催乳素受体基因  19
    1.2.4 其他与繁殖性状相关的候选基因的研究情况  19
  1.3 视黄醇结合蛋白基因的研究进展  19-26
    1.3.1 视黄醇结合蛋白基因的结构及染色体定位  20-22
    1.3.2 视黄醇结合蛋白基因的作用机理  22-23
    1.3.3 视黄醇结合蛋白基因的转录情况和发育性表达  23-25
    1.3.4 视黄醇结合蛋白基因与家畜生产性能的关系  25-26
    1.3.5 视黄醇结合蛋白基因的临床意义  26
  1.4 视黄酸受体和视黄素X受体的研究进展  26-32
    1.4.1 核受体超家族及其辅调因子的研究进展  26-29
    1.4.2 视黄酸受体的研究进展  29-31
    1.4.3 视黄酸X受体的研究进展  31-32
    1.4.4 视黄酸受体和视黄素X受体对猪繁殖性状的影响  32
  1.5 甲状腺素运载蛋白的研究进展  32-33
  1.6 本研究的目的和意义  33-34
2 研究内容  34-108
  试验一 猪的RBP4基因及RARs、RXRs和TTR基因的转录情况  34-61
    2.1 实验材料  34-35
      2.1.1 实验动物  34-35
      2.1.2 组织样品  35
      2.1.3 药品和酶  35
      2.1.4 仪器设备  35
    2.2 实验方法  35-39
      2.2.1 总RNA提取  35-36
      2.2.2 总RNA质量检测  36
      2.2.3 引物设计与合成  36-37
      2.2.4 反转录  37-38
      2.2.5 PCR扩增体系及反应条件  38
      2.2.6 琼脂糖凝胶电泳  38
      2.2.7 半定量RT-PCR反应中循环参数的确定  38-39
      2.2.8 半定量RT-PCR分析  39
      2.2.9 数据分析  39
    2.3 实验结果  39-54
      2.3.1 RBP4基因的时空转录情况  39-41
      2.3.2 RARs和RXRs基因的时空转录情况  41-50
      2.3.3 TTR基因的时空转录情况  50-51
      2.3.4 半定量RT-PCR检测RBP4基因的转录情况  51-54
    2.4 讨论  54-60
      2.4.1 RT-PCR方法的构建  54
      2.4.2 不同日龄大白猪的RBP4基因的转录情况  54-55
      2.4.3 不同日龄大白猪的RARs基因的转录情况及与RBP4的关系  55-57
      2.4.4 不同日龄大白猪RXRs基因的转录情况与及与RBP4的关系  57-59
      2.4.5 不同日龄大白猪的TTR基因的转录情况及与RBP4的关系  59-60
    2.5 小结  60-61
  实验二 成纤维细胞系中添加VA诱导RBP4基因及RARs、RXRs和TTR基因转录变化情况研究  61-82
    2.1 实验材料  61-63
      2.1.1 大白猪的成纤维细胞系  61
      2.1.2 主要药品及培养皿  61
      2.1.3 主要溶液的配制  61-62
      2.1.4 主要仪器  62
      2.1.5 实验方法  62-63
    2.2 实验结果  63-78
      2.2.1 添加诱导物后细胞生长情况  63-64
      2.2.2 PCR扩增循环参数的确定  64-67
      2.2.3 添加不同浓度的VA后RBP4基因、RARs、RXRs和TTR基因转录变化情况  67-78
    2.3 讨论  78-81
      2.3.1 VA对猪的繁殖性状的影响  78-79
      2.3.2 添加VA后对目的基因诱导转录情况  79-81
    2.4 小结  81-82
  试验三 猪血清中视黄醇结合蛋白和维生素A含量的测定与分析  82-90
    2.1 实验材料  82-84
      2.1.1 实验动物  82
      2.1.2 实验药品  82
      2.1.3 主要仪器设备  82-83
      2.1.4 实验方法  83-84
    2.2 实验结果  84-87
      2.2.1 血清中RBP和VA的含量  84
      2.2.2 血清中RBP含量和VA含量的相关性分析  84-85
      2.2.3 血清中RBP和VA含量的高低与1月龄体重的关系  85-87
    2.3 讨论  87-89
      2.3.1 ELISA技术的特点  87
      2.3.2 HPLC技术的特点  87-88
      2.3.3 血清中RBP和VA含量的测定及与1月龄体重的关系  88-89
    2.4 小结  89-90
  实验四 猪RBP4基因成熟肽在毕赤酵母中的表达  90-108
    2.1 实验材料  90-92
      2.1.1 组织样  90
      2.1.2 主要试剂  90-91
      2.1.3 常用储备液及缓冲液的配制  91-92
      2.1.4 培养基  92
      2.1.5 主要仪器设备  92
    2.2 实验方法  92-98
      2.2.1 RNA的提取  92-93
      2.2.2 引物的设计与合成  93
      2.2.3 猪的RBP4基因成熟肽的cDNA序列扩增  93
      2.2.4 PCR产物的克隆测序  93
      2.2.5 RBP4基因转录片段的获得  93-94
      2.2.6 pPICZαC载体质粒DNA的处理  94
      2.2.7 构建转录载体pPICZαC-RBP4  94
      2.2.8 转化  94
      2.2.9 测序  94
      2.2.10 富集质粒  94-95
      2.2.11 线性化重组质粒  95
      2.2.12 线性化重组质粒的纯化  95
      2.2.13 制备酵母感受态  95
      2.2.14 线性化重组质粒导入酵母细胞  95-96
      2.2.15 酵母基因组提取  96
      2.2.16 PCR鉴定  96
      2.2.17 Mut表型鉴定  96
      2.2.18 甲醇诱导转录  96-97
      2.2.19 采用TCA法浓缩上清中的蛋白  97
      2.2.20 SDS-PAGE凝胶电泳  97
      2.2.21 转膜  97-98
      2.2.22 免疫反应  98
    2.3 实验结果  98-104
      2.3.1 猪RBP4基因的RT-PCR扩增  98-99
      2.3.2 重组克隆质粒PMD18-T-RBP4的鉴定  99
      2.3.3 猪RBP4基因序列的测定  99
      2.3.4 表达载体构建流程图  99
      2.3.5 pPICZαC质粒及PCR产物的双酶切和回收  99-100
      2.3.6 重组质粒pPICZαC-RBP4的鉴定  100-102
      2.3.7 Mut表型鉴定  102
      2.3.8 PCR鉴定  102-103
      2.3.9 目的蛋白的Western-Blot检测  103-104
    2.4 讨论  104-107
      2.4.1 酵母转录系统的优越性  104
      2.4.2 目的基因对系统的适应性  104-105
      2.4.3 pPICZαC载体情况  105
      2.4.4 重组质粒的构建结果分析  105-106
      2.4.5 重组质粒在酵母细胞中的表达  106-107
    2.5 小结  107-108
3 结论  108-110
致谢  110-111
参考文献  111-121
攻读博士学位期间发表的学术论文  121

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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