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甜菜夜蛾滞育激素—性信息素合成激活肽基因（DH-PBAN）和促前胸腺激素（PTTH）基因的克隆和表达分析

作　者: 徐军
导　师: 徐卫华
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 遗传学
关键词: 滞育激素促前胸腺激素 6-磷酸海藻糖合成酶滞育海藻糖克隆发育表达棉铃虫甜菜夜蛾
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

利用兼并引物分别扩增出甜菜夜蛾的促前胸腺激素(prothoracicotropic hormone，PTTH)和滞育激素的学位论文">滞育激素(diapause hormone，DH)cDNA，克隆和测序结果显示出PTTH cDNA包含一个编码226个氨基酸的开放阅读框：信号肽、一个未知肽和PTTH。和其它已知物种的PTTH比较，甜菜夜蛾和夜蛾科昆虫有较高的同源性，和其它昆虫的相似性稍低，但是PTTH分子中的7个半胱氨酸残基的位置是保守且一致的。用棉铃虫PTTH抗体进行整体免疫组织化学检测，发现PTTH在甜菜夜蛾脑中的两对神经分泌细胞中表达。Northern杂交表明PTTH mRNA约1.2kb，特异表达在脑组织。半定量RT-PCR检测了PTTH在幼虫期和蛹期的发育变化，显示出PTTH表达和蜕皮变态有密切的关系，暗示PTTH在甜菜夜蛾行使其生物学功能很可能也是通过刺激前胸腺合成和分泌蜕皮激素来完成的。从甜菜夜蛾咽下神经节克隆到全长为798bp的DH cDNA，该基因开放阅读框编码197个氨基酸，包含DH、性信息素合成激活肽和3个功能未知的咽下神经节神经肽，它们的C末端都是保守的FXPR／KL(X=G、T、S)序列，和已知鳞翅目昆虫DH cDNA有较高同源性，且组织结构相同。Northern分析显示DH mRNA特异表达于咽下神经节，转录本为800bp，在幼虫和成虫中表达较高，可能和幼虫发育和刺激成虫分泌性信息素有关，暗示DH基因除了调节昆虫滞育外，可能有其它的生理功能。滞育激素和促前胸腺激素在非滞育昆虫甜菜夜蛾中均有表达，在时空上显出特定的表达模式，说明它们和生长发育相关。对棉铃虫滞育蛹的抗寒机理的调查，发现海藻糖含量在滞育和非滞育棉铃虫蛹个体有显著差异。海藻糖是主要的昆虫血糖，海藻糖的合成依赖于6-磷酸海藻糖合成酶。据此，我们克隆了棉铃虫6-磷酸海藻糖合成酶cDNA，该cDNA全长1827bp，开放阅读框编码536个氨基酸的合成酶，用家蚕杆状病毒体系表达6-磷酸海藻糖合成酶，成功获得具有酶活性的蛋白。对棉铃虫不同发育时期的血淋巴进行6-磷酸海藻糖合成酶酶活分析，发现酶活的变化趋势和血淋巴海藻糖含量的变化趋势基本一致；用Northern blot检测6-磷酸海藻糖mRNA的组织分布，其在滞育棉铃虫的脂肪体和卵巢中特异表达；RT-PCR分析其发育表达，结果和酶活及海藻糖含量变化吻合。

全文目录

缩略词表  8-10
摘要  10-11
Abstract  11-12
第一部分甜菜夜蛾滞育激素的学位论文">滞育激素和促前胸腺激素基因的克隆和表达分析  12-39
  1.前言  12-19
    1.1 昆虫激素概述  12-16
      1.1.1 激脂激素  12-13
      1.1.2 利尿肽和抗利尿肽  13
      1.1.3 亲肌肽类神经肽  13
      1.1.4 促咽侧体素和抑咽侧体素  13-15
      1.1.5 羽化激素和蜕皮触发激素  15-16
      1.1.6 F类神经肽  16
      1.1.7 色素分散因子  16
      1.1.8 SI/LFamide神经肽  16
      1.1.9 遗忘素  16
      1.1.10 Pacifastins和Neuroparsins  16
    1.2 促前胸腺激素(PTTH)及其研究进展  16-17
    1.3 FXPR/KLamde神经肽研究进展  17-18
    1.4 小结  18-19
  2.材料与方法  19-27
    2.1 昆虫的饲养及组织材料收集  19
    2.2 总RNA的抽提  19
    2.3 反转录合成cDNA第一链  19
    2.4 PCR反应  19-20
    2.5 DNA电泳和胶回收  20
    2.6 感受态细胞制备和连接转化  20
      2.6.1 感受态细胞制备:  20
      2.6.2 连接  20
      2.6.3 转化过程  20
    2.7 质粒DNA的少量制备  20-21
    2.8 RACE反应  21-22
    2.9 Northern杂交  22-26
      2.9.1 制备变性胶  22
      2.9.2 制样  22-23
      2.9.3 电泳  23
      2.9.4 转膜  23
      2.9.5 洗膜  23
      2.9.6 预杂交  23
      2.9.7 制备~(32)P标记探针  23-24
      2.9.8 杂交  24
      2.9.9 洗膜  24-25
      2.9.10 曝光、冲片  25
      2.9.11 洗膜  25
      2.9.12 试剂  25-26
    2.10 半定量RT-PCR  26
    2.11 免疫组化  26-27
  3 结果与讨论  27-39
    3.1 甜菜夜蛾DH-PBAN cDNA的克隆及其时空表达分析  27-32
      3.1.1 甜菜夜蛾DH-PBAN cDNA中间片段的获得  27
      3.1.2 快速扩增cDNA末端获得全长cDNA  27
      3.1.3 甜菜夜蛾DH-PBAN cDNA序列结构及同源性分析  27-28
      3.1.4 甜菜夜蛾DH-PBAN mRNA的组织分布  28-30
      3.1.5 甜菜夜蛾DH-PBAN mRNA在蛹的不同发育时期的表达变化  30-31
      3.1.6 小结  31-32
    3.2 甜菜夜蛾PTTH cDNA的克隆及其时空表达分析  32-38
      3.2.1 甜菜夜蛾PTTH cDNA中间片段的获得  32
      3.2.2 全长PTTH cDNA的获得  32-33
      3.2.3 甜菜夜蛾PTTH cDNA的序列结构及同源性分析  33
      3.2.4 Spe-PTTH mRNA的组织分布  33
      3.2.5 Spe-PTTH的发育变化  33-37
      3.2.6 Spe-PTTH蛋白的组织定位  37
      3.2.7 小结  37-38
    3.3 本章总结与展望  38-39
第二部分棉铃虫海藻糖合成酶基因的克隆和功能研究  39-55
  1.前言  39-42
    1.1 多羟基化合物与昆虫滞育、抗寒的关系  39-40
    1.2 海藻糖的发现与功能  40
    1.3 海藻糖的合成与海藻糖合成酶基因研究进展  40-42
  2 材料方法  42-45
    2.1 昆虫的饲养  42
    2.2 材料的收集和处理  42
      2.2.1 组织和血淋巴的收集  42
      2.2.2 血淋巴中蛋白质的除去  42
      2.2.3 多羟基化合物的衍生  42
    2.3 HPLC  42
    2.4 6—磷酸海藻糖合成酶酶活测定  42-43
    2.5 简并引物扩增TPS中间片段  43
    2.6 全长TPS cDNA的获得  43
    2.7 RT-PCR检测TPS的发育表达  43
    2.8 利用家蚕杆状病毒表达体系表达TPS  43-45
      2.8.1 PCR扩增用于表达到的全长TPS ORF  43
      2.8.2 PCR条件  43-44
      2.8.3 TPS基因的亚克隆  44
      2.8.4 共转染与重组病毒的制备  44
      2.8.5 SDS-PAGE电泳  44-45
  3 结果与讨论  45-55
    3.1 棉铃虫血淋巴中抗寒类物质的含量变化趋势  45
    3.2 棉铃虫血淋巴中海藻糖合成酶活性检测  45-49
    3.3 6—磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因中间片段的获得  49
    3.4 6—磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因全长cDNA的克隆  49
    3.5 6—磷酸海藻糖合成酶(TPS)cDNA开放阅读框的杆状病毒表达  49-52
    3.6 6—磷酸海藻糖合成酶(TPS)mRNA的组织分布  52
    3.7 6—磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因的发育表达分析  52-54
    3.8 小结与讨论  54-55
参考文献  55-64
致谢  64-65
博士期间已发表和待发表的论文  65

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