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家蚕滞育激素受体基因的结构和表达特性及功能分析

作　者: 王力刚
导　师: 沈兴家
学　校: 江苏科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕滞育激素受体催青温度基因表达分析实时荧光定量PCR 启动子昆虫激素
分类号: S881.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

家蚕(Bombyx mori)是一种重要的经济昆虫和模式生物,研究家蚕滞育的分子机理具有重要的理论和实践意义。家蚕在长期的进化过程中形成了卵滞育的特性,其滞育性由遗传性和环境条件支配。根据家蚕的滞育性可将其分为一化性、二化性和多化性品种。家蚕二化性品种的滞育性受上代环境影响,卵期25℃高温明催青则产滞育卵,而15℃低温暗催青则产非滞育卵。家蚕胚胎滞育与蛹期咽下神经节(subpharyngeal ganglion,SG)合成和分泌的滞育激素(diapause hormone,DH)密切相关,而DH必须通过滞育激素受体(BmDHR)才能发挥作用。为了探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,本论文对Bmdhr基因的结构、表达谱和功能特性进行了初步研究。1、Bmdhr基因结构分析从NCBI下载Bmdhr mRNA-1~Bmdhr mRNA-5的序列(登录号:AB164386 ~AB164390),在家蚕基因组数据库进行在线基因组比对,用DNASTAR软件包进行ORF分析并推导其相应的氨基酸序列;用TMHMM service v. 2.0程序分析蛋白跨膜区。结果显示,Bmdhr为单拷贝基因,全长约33.79 kb,包含7个外显子和6个内含子;其5个mRNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mRNA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,为同一种受体;BmDHR-1含有7个跨膜区域,BmDHR-3、BmDHR-4和BmDHR-5分别含5个跨膜区域。2、Bmdhr基因的时空表达特性及催青温度对表达的影响将家蚕二化性品种“秋丰”的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR技术分析了催青温度对家蚕不同发育时期及组织中Bmdhr基因mRNA转录水平的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青高于低温催青;Bmdhr mRNA-4主要在各发育时期的血液中表达,在高温明催青下,其在蛹体血液中的转录水平是低温催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种次代是否滞育的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2~3 d的卵巢中转录水平较高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平下降,至化蛹后4~5 d时2种催青处理间的转录水平无显著差异。3、Bmdhr基因启动子特性分析在生物信息学分析的基础上从家蚕基因组DNA中克隆了包含不同调控序列的Bmdhr基因的启动子,使用pGL3.0 basic载体构建了报告质粒,对不同长度的启动子序列进行了活性分析,比较了不同浓度的保幼激素类似物(JHA)、蜕皮激素(MH)和滞育激素(DH)及激素组合对Bmdhr基因启动子活性的影响。结果显示,Bmdhr转录起始位点上游-941～-1364 nt区间可能存在负调控元件。MH浓度为4μg/mL时,启动子的活性显著减弱,其余浓度则极显著增强。JHA浓度分别为2、4、6、10μg/mL时,启动子活性极显著增强,而1μg/mL时显著减弱, 8μg/mL时则极显著减弱。MH和JHA浓度均为1、2、4、6μg/mL时,启动子活性显著增加,其中1μg/mL时活性最高;而二者浓度均为8、10μg/mL的条件下,启动子活性变化不显著。DH浓度在0~60 nM之间,启动子活性显著增加,其中20 nM左右活性最高,浓度大于60 nM时,启动子活性变化不显著。4、BmDHR的真核表达及功能分析以pcDNA3.1载体为骨架,构建了IE-1启动子-BmDHR表达质粒,并分别检测了各种BmDHR对家蚕海藻糖酶基因(Bmtrehelase)启动子活性的影响。结果显示,4种滞育激素受体BmDHR-1、BmDHR-3、BmDHR-4和BmDHR-5分别单独大量表达时,均能上调下游海藻糖酶基因启动子的活性;不同比例(1:3、1:1和3:1)的BmDHR-1 /BmDHR-5均能上调海藻糖酶启动子活性,并且二者共同强表达时BmDHR-5有一定的抑制作用;BmDHR-1/BmDHR-5比例为1:3时,上调倍数与BmDHR-1单独作用时相当。本论文研究了Bmdhr基因的结构、表达谱和功能特性,为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-17
第1章绪论  17-26
  1.1 昆虫滞育  17-19
    1.1.1 滞育的涵义  17
    1.1.2 滞育的阶段  17-19
  1.2 家蚕滞育研究概况  19-24
    1.2.1 家蚕滞育激素  19
    1.2.2 家蚕滞育机理  19-23
    1.2.3 家蚕滞育激素受体研究进展  23-24
  1.3 本文的主要内容  24-26
第2章家蚕滞育激素受体基因结构分析  26-30
  2.1 引言  26
  2.2 材料与方法  26-27
    2.2.1 数据分析软件  26
    2.2.2 实验方法  26-27
  2.3 结果与分析  27-28
    2.3.1 家蚕基因组精细图比对结果  27
    2.3.2 蛋白质一级结构分析  27-28
  2.4 讨论  28-29
  2.5 本章小结  29-30
第3章家蚕滞育激素受体基因的时空表达特性及催青温度对表达的影响  30-46
  3.1 引言  30-31
  3.2 材料与方法  31-35
    3.2.1 材料与试剂  31-33
    3.2.2 实验方法  33-35
  3.3 结果与分析  35-44
    3.3.1 总RNA质量检验及引物特异性分析  35-36
    3.3.2 Real-Time PCR中扩增曲线和溶解曲线  36-37
    3.3.3 Bmdhr基因在幼虫期的表达分析  37-38
    3.3.4 Bmdhr基因在蛹期的表达分析  38-43
    3.3.5 Bmdhr基因在成虫期的表达分析  43-44
  3.4 讨论  44-45
  3.5 本章小结  45-46
第4章家蚕滞育激素受体基因启动子特性分析  46-64
  4.1 引言  46-47
  4.2 材料与方法  47-55
    4.2.1 实验试剂  47-50
    4.2.2 实验方法  50-55
  4.3 结果与分析  55-61
    4.3.1 家蚕基因组DNA的提取  55-56
    4.3.2 家蚕滞育激素受体基因启动子区域片段的扩增  56
    4.3.3 重组质粒pMD- Bmdhr-1407 与pMD- Bmdhr-984 的酶切鉴定  56
    4.3.4 Bmdhr基因启动子的测序结果与分析  56-57
    4.3.5 报告质粒的酶切鉴定  57-58
    4.3.6 不同长度的Bmdhr启动子活性分析  58-59
    4.3.7 保幼激素类似物对Bmdhr启动子活性的影响  59
    4.3.8 β-蜕皮激素对Bmdhr启动子活性的影响  59-60
    4.3.9 β-蜕皮激素与保幼激素类似物复合使用对Bmdhr启动子活性的影响  60-61
    4.3.10 滞育激素对Bmdhr启动子活性的影响  61
  4.4 讨论  61-62
  4.5 本章小结  62-64
第5章家蚕滞育激素受体基因的真核表达与功能分析  64-73
  5.1 引言  64
  5.2 材料与方法  64-68
    5.2.1 实验试剂  64-65
    5.2.2 实验方法  65-68
  5.3 结果与分析  68-71
    5.3.1 家蚕滞育激素受体基因各ORF cDNA的扩增  68-69
    5.3.2 重组质粒pMD-Bmdhr的酶切鉴定  69
    5.3.3 BmDHR表达质粒的酶切鉴定  69-70
    5.3.4 BmDHR对海藻糖酶基因启动子活性的影响  70-71
    5.3.5 BmDHR-1 与BmDHR-5 共表达分析  71
  5.4 讨论  71-72
  5.5 本章小结  72-73
结论  73-75
参考文献  75-82
攻读硕士期间发表的学术论文  82-83
致谢  83-84
详细摘要  84-89

家蚕滞育激素受体基因的结构和表达特性及功能分析

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