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大豆疫霉侵染大豆早期差异表达基因的筛选与功能分析

作　者: 申贵
导　师: 郑小波
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉 侵染早期 抑制性差减杂交 基因筛选 PsPHGPx PsDIP 过敏反应
分类号: S435.651
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


由大豆疫霉（P.sojae）引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，每年造成大豆损失达10多亿美元。大豆疫霉是一种卵菌，卵菌在进化上和藻类同属于假菌界而和真菌相差很远，因此，很多病原真菌致病性分子机理并不适合于卵菌。目前植物病原卵茵的致病性在分子水平上还远未得到研究，对包括大豆疫霉在内的病原卵菌分子机理的研究有助于寻找到特异的防治卵菌病害的分子靶标，从而有利于病害的控制。本研究用SSH的方法试图从宏观的角度来分析大豆疫霉在侵染早期有哪些基因受到诱导，哪些基因受到抑制。另外，本研究从得到的基因中选择了磷脂过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶基因和能够引起烟草发生坏死反应的一种效应因子基因，分析了它们在致病过程及在非寄主抗性中的可能作用。 首先，为了确定大豆疫霉在侵染早期有哪些基因差异表达、参与了早期的互作过程，本研究采用了抑制性差减杂交技术，以离体培养的大豆疫霉为driver，以侵染大豆品种合丰35的大豆疫霉为tester，构建了侵染过程中上调和下调表达文库。通过点杂交（dot-blot microarray）和virtual Northern杂交筛选，共获得了487个克隆，经过DNA测序并在已知的核酸与蛋白数据库中比对分析，发现所获得的EST序列在这些数据库中均有高度同源序列，其中所有序列在大豆疫霉基因组数据库中均有高度配对的序列，最终这两个文库中共有105个unigene差异表达。经分析，这些基因在侵染时上调表达的有43个，下调表达的有62个，这些基因涉及能量代谢、转录、信号传导及氧化还原平衡等信号途径，提示大豆疫霉侵染大豆是一个复杂的多基因参与的过程。肌酸激酶在侵染时上调表达，而RT-PCR分析显示细胞色素c在侵染过程中随着肌酸激酶基因表达的增加而减少，提示大豆疫霉在侵染初期可能主要利用磷酸肌酸来维持其侵染所需要的能量。本研究首次报道了大豆疫霉在亲和互作条件下在侵染早期差异表达的基因，研究结果对认识大豆疫霉侵染早期与识别、侵入和定殖相关的分子机制有理论与实践意义。 从大豆疫霉与寄主互作的SSH文库的下调表达基因中得到了PsPHGPx基因。PHGPx具有抗细胞膜脂质过氧化的作用。在互作中寄主植物产生活性氧以抵抗病原茵的侵染，病原菌的抗氧化基因在亲和互作中上调表达，表明这些基因参与了侵染过程。本研究确认了大豆疫霉的PHGPx在亲和互作中的作用，同时还对其功能做了初步分析。在酵母中异源表达PsPHGPx能够抑制Bax诱导的酵母细胞凋亡。PsPHGPx受到H2O2等氧化压力以及其它逆境条件和钙离子的诱导，

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
引言  13-15
上篇 文献综述  15-63
  第一章 卵菌分子遗传学研究进展  15-42
    第一节 卵菌生物学  15-16
    第二节 卵菌基因组及功能基因组学  16-23
      1.基因组大小  16-17
      2.基因组组成  17
      3.基因结构  17-19
      4.疫霉菌基因组  19-20
      5.基因组的不稳定性  20-21
      6.疫霉菌功能基因组学  21-23
    第三节 分子生物学技术平台  23-26
      1.DNA转化技术  23-24
      2.报告基因  24
      3.基因沉默  24-25
      4.遗传图谱  25-26
    第四节 卵菌(疫霉菌)与植物互作的分子机制  26-31
      1.疫霉菌致病性机制  26-30
        1.1 游动孢子的产生、释放及萌发的细胞生物学和分子遗传学  26-28
        1.2 疫霉菌在寄主组织上附着、穿透和定殖  28-29
        1.3 抑制寄主防卫反应  29-30
      2.植物防卫反应  30-31
    参考文献  31-42
  第二章 真菌在寄主组织定殖阶段相关基因研究进展  42-63
    第一节 真菌在寄主组织上定殖时差异表达基因的发现  42-48
      1.病原菌侵染早期：附着植物表面、孢子萌发及附着胞发育  43-44
      2.活体营养阶段抵抗植物防卫反应  44-45
      3.活体营养阶段从寄主中获取营养  45
      4.死体营养和孢子形成阶段  45-48
    第二节 互作过程中植物产生的信号及诱导基因的调节因子  48-50
    第三节 致病性信号传导机制  50-54
      1.G蛋白信号途径  50-51
      2.cAMP信号途径  51-52
      3.MAPK途径  52-54
    参考文献  54-63
下篇 研究内容  63-147
  第一章 大豆疫霉侵染早期差异表达基因的筛选与分析  63-102
    1.材料和方法  65-77
      1.1 材料  66
        1.1.1 供试菌株及大豆  66
        1.1.2 供试药剂和培养基  66
      1.2 方法  66-77
        1.2.1 大豆疫霉的培养和接种方法  66
        1.2.2 菌丝丛接种大豆叶片的形态学观察  66-67
        1.2.3 菌丝RNA的提取方法(TRIzol法)  67
        1.2.4 SSH过程  67-70
        1.2.5 感受态大肠杆菌的制备及SSH-PCR产物的T／A克隆  70-71
        1.2.6 质粒提取方法(碱裂解法)  71
        1.2.7 文库质粒的点杂交方法  71-72
        1.2.8 Virtual Northern杂交方法  72-74
        1.2.9 阳性克隆的测序和序列分析方法  74
        1.2.10 半定量RT-PCR分析方法  74-77
    2.结果  77-93
      2.1 接种大豆叶片的菌丝形态变化  77-78
      2.2 抑制性差减文库的构建及阳性克隆的点杂交筛选  78-79
      2.3 序列比对及生物信息学分析  79-90
      2.4 virtual Northern分析  90-91
      2.5 RT-PCR分析  91-93
    3.讨论  93-96
    参考文献  96-102
  第二章 PsPHGPx抑制Bax诱导的酵母细胞凋亡及其表达调控研究  102-128
    1.材料和方法  104-110
      1.1 材料  104-105
        1.1.1 供试菌株和植物材料  104
        1.1.2 培养基  104-105
        1.1.3 化学试剂  105
      1.2 方法  105-110
        1.2.1 大豆疫霉菌株Pmg2菌丝DNA和RNA的提取及cDNA的合成方法  105-106
        1.2.2 大豆疫霉PsPHGPx基因和启动子部分序列的克隆及其生物信息学分析方法  106-107
        1.2.3 Southern杂交分析方法  107
        1.2.4 电转化方法  107-108
        1.2.5 酵母实验方法  108-109
        1.2.6 不同条件处理大豆疫霉菌丝的方法  109-110
        1.2.7 不同条件处理大豆疫霉菌丝的RT-PCR分析方法  110
    2.结果  110-121
      2.1 PsPHGPx基因序列分析  110-113
      2.2 大豆疫霉PHGPx的启动子含有压力反应元件和SRE元件  113
      2.3 大豆疫霉PHGPx基因在基因组中的拷贝数  113-116
      2.4 大豆疫霉PHGPx抑制Bax诱导的酵母细胞凋亡  116-117
      2.5 大豆疫霉PsPHGPx的表达调控研究  117-121
        2.5.1 逆境诱导大豆疫霉PsPHGPx的表达  117-118
        2.5.2 钙信号途径参与了大豆疫霉PHGPx的诱导表达  118-119
        2.5.3 PsPHGPx在大豆疫霉与大豆亲和互作中上调表达  119-121
    3.讨论  121-123
    参考文献  123-128
  第三章 大豆疫霉一种新的激发子基因的克隆与功能分析  128-147
    1.材料和方法  130-136
      1.1 材料  130
        1.1.1 供试菌株和植物材料  130
        1.1.2 培养基  130
      1.2 方法  130-136
        1.2.1 大豆疫霉菌株Pmg2的DNA和RNA的提取方法  130
        1.2.2 大豆疫霉PsDIP基因的克隆及序列分析方法  130-131
        1.2.3 Southern杂交分析方法  131
        1.2.4 PsDIP基因的RT-PCR分析方法  131
        1.2.5 大肠杆菌JM109、BL21感受态细胞的制备  131
        1.2.6 PVX：：PsDIP及pET32b：：PsDIP表达载体的构建  131-133
        1.2.7 农杆菌感受态细胞的制备和转化方法  133
        1.2.8 烟草及棉花坏死反应分析方法  133-134
        1.2.9 烟草PR基因表达分析方法  134-135
        1.2.10 PsDIP功能域分析方法  135-136
    2.结果  136-143
      2.1 大豆疫霉PsDIP基因序列分析  136-139
      2.2 PsDIP基因的Southern杂交分析  139
      2.3 PsDIP基因在亲和互作中下调表达  139-140
      2.4 PsDIP引起烟草发生过敏性坏死反应  140-141
        2.4.1 PVX：：PsDIP引起烟草发生过敏性坏死反应  140
        2.4.2 PsDIP原核表达蛋白引起烟草发生坏死反应  140-141
      2.5 PsDIP原核表达蛋白注射烟草引起烟草PR基因的表达  141
      2.6 PsDIP的功能域研究  141-143
        2.6.1 PsDIP(N15-)引起烟草产生过敏反应  141
        2.6.2 PsDIP(h-)不能使烟草产生过敏反应  141-143
    3.讨论  143-144
    参考文献  144-147
附录  147-157
  附录一：研究内容第三章构建的4个重组质粒的酶切验证  147-148
  附录二：第四章 不同寄主来源寄生疫霉菌株的遗传变异分析  148-157
博士期间发表的论文  157-158
致谢  158

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 大豆病虫害
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